Definition des Filarien-N

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 7951 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die N-verknüpfte Glykosylierung ist eine entscheidende posttranslationale Modifikation eukaryotischer Proteine. N-verknüpfte Glykane sind auf der Oberfläche vorhanden und sezernieren Filarienproteine, die bei der Interaktion mit dem Wirt und Parasiten eine Rolle spielen. Beispiele für glykosylierte Brugia malayi-Proteine ​​wurden bereits früher identifiziert, es gab jedoch keine systematische Untersuchung des N-verknüpften Glykoproteoms dieses oder eines anderen Filarienparasiten. In dieser Studie haben wir ein verbessertes N-Glyko-FASP-Protokoll unter Verwendung eines manipulierten Kohlenhydrat-bindenden Proteins, Fbs1, angewendet, um N-glykosylierte Peptide für die Analyse mittels LC-MS/MS anzureichern. Anschließend kartierten wir die N-Glykosite auf Proteinen aus drei Wirtsstadien des Parasiten: erwachsenes Weibchen, erwachsenes Männchen und Mikrofilarien. Die Fbs1-Anreicherung von N-glykosylierten Peptiden verbesserte die Identifizierung von N-Glykositen. Unsere Daten identifizierten 582 N-verknüpfte Glykoproteine ​​mit 1273 N-Glykositen. Die Genontologie und die Vorhersage der Zelllokalisierung der identifizierten N-Glykoproteine ​​deuteten darauf hin, dass es sich hauptsächlich um Membran- und extrazelluläre Proteine ​​handelte. Beim Vergleich der Ergebnisse von erwachsenen weiblichen Würmern, erwachsenen männlichen Würmern und Mikrofilarien stellen wir fest, dass die N-Glykosylierung sowohl auf Proteinebene als auch auf der Ebene einzelner N-Glykositen variiert. Diese Variationen werden bei Kutikula-N-Glykoproteinen und N-Glykoproteinen bei erwachsenen Würmern als Beispiele für Proteine ​​an der Schnittstelle zwischen Wirt und Parasit hervorgehoben, die als potenzielle therapeutische Ziele oder Biomarker gut positioniert sind.

Brugia malayi ist einer von drei menschlichen Filarienparasiten, die lymphatische Filariose verursachen, eine schwächende und chronisch vernachlässigte Tropenkrankheit, die derzeit mehr als 859 Millionen Menschen in 50 Ländern weltweit bedroht1,2. Die Symptome bei einzelnen Personen können von leicht bis schwer reichen, einschließlich einer Schädigung des Lymphsystems und der Nieren und schließlich einer Verstopfung der Lymphgefäße mit Schwellung der Genitalien und Gliedmaßen1,2. Erwachsene Würmer, die im Lymphsystem immunkompetenter Personen leben, können durchschnittlich 6–8 Jahre überleben. Weibliche Würmer setzen Millionen von Mikrofilarien (unreife Larven) frei, die in den Blutkreislauf gelangen, wo sie von den Mücken, den Insekten, die diese Parasiten übertragen, aufgenommen werden können. Bei Mücken häuten sich die Mikrofilarien und entwickeln sich über mehrere Stadien zum infektiösen dritten Larvenstadium (L3), das dann durch eine Blutmahlzeit auf andere Menschen übertragen werden kann. Diese L3-Larven häuten sich dann und reifen heran, während sie zum Lymphsystem wandern, wo sie den Lebenszyklus abschließen1,2. Im Rahmen der WHO-Bemühungen zur Ausrottung der Krankheit wurden in 66 Ländern mehr als 7 Milliarden Behandlungen zur Bekämpfung der lymphatischen Filariose durchgeführt1,3. Aktuelle Behandlungen verringern zwar wirksam die Übertragung, indem sie die im Blut zirkulierenden Mikrofilarien verringern oder eliminieren, töten jedoch nicht die erwachsenen Würmer ab, die für die mit Filariose verbundenen Symptome verantwortlich sind3,4. Darüber hinaus wurden Berichte über aufkommende Resistenzen gegen aktuelle Behandlungen gemeldet5,6. Um die verfügbaren Kontrollmaßnahmen zu erweitern, sind zusätzliche Studien zur Erweiterung der verfügbaren Arzneimitteloptionen und Arzneimittelziele erforderlich.

Parasitenvermittelte Wechselwirkungen mit dem Säugetierwirt wie Immunmodulation und Immunumgehung ermöglichen die langjährige Existenz von B. malayi und anderen Filarienparasiten in immunkompetenten Wirten und stellen ein aktives Forschungsgebiet dar7. Glykokonjugate, die an der Wurmoberfläche vorhanden sind, abgesondert oder ausgeschieden werden oder in extrazellulären Vesikeln vorhanden sind, die der Parasit in den Wirt freisetzt, sind allesamt Teil entscheidender Mechanismen, die es diesen Parasiten ermöglichen, jahrelang ohne Clearance zu existieren8,9,10,11. Eine detaillierte Charakterisierung dieser kritischen Moleküle und ihrer Synthesewege kann mögliche Biomarker, therapeutische Ziele, Impfstoffmoleküle oder Diagnosewerkzeuge für die weitere Entwicklung hervorheben. Der aktuelle diagnostische Test für lymphatische Filariose ist beispielsweise der Nachweis des zirkulierenden Filarienantigens von Wuchereria bancrofti durch einen monoklonalen Antikörper12. Jüngste Studien haben gezeigt, dass es sich bei dem erkannten Epitop um ein Glykan handelt und weitere Studien erforderlich sind, um die Struktur vollständig zu charakterisieren13.

Eine wichtige Klasse von Glykokonjugaten sind N-glykosylierte Proteine ​​oder N-verknüpfte Glykoproteine. N-Glykosylierung ist eine komplexe posttranslationale Modifikation, bei der Glykane an den Stickstoff bestimmter Asparaginreste in einem Protein gebunden werden und bei vielen biologischen Prozessen eine Rolle spielen, einschließlich Faltung, Stabilität und Funktion des Proteins14. Beispiele für die Rolle, die die N-Glykosylierung bei Interaktionen mit Wirtspathogenen spielt, sind bei Viren gut bekannt und umfassen die Abschirmung, um die Umgehung des Immunsystems zu ermöglichen, die Erhöhung der Infektiosität und die Veränderung der Virulenz15. Zu den Oberflächen-N-Glykoproteinen, die das Virus nachweislich vor dem Immunsystem des Wirts schützen, gehören insbesondere das Influenza-Hämagglutinin-Glykoprotein16, das HIV-1-Hüll-Spike-Protein (gp120/gp41)17 und das SARS-CoV2-Spike-Protein18. Ähnliche Strategien könnten bei metazoischen Parasiten eine Rolle spielen. Darüber hinaus verleiht die Anordnung und Modularität der N-Glykane ein Maß an Diversität, das der Parasit sowohl für kurz- als auch langfristige Heterogenität nutzen kann, wie kürzlich für Acanthocheilonema viteae ES-6219 nachgewiesen wurde, und wahrscheinlich für die Interaktionen zwischen Wirt und Parasit wichtig ist14. 20. Es wird angenommen, dass sich diese anpassungsfähigen, posttranslational modifizierten Proteine ​​des N-Glykoproteoms stärker entwickeln als das Proteom des Organismus und im Vergleich zu anderen Arten weniger konserviert sind21. Daher wird erwartet, dass das N-Glykoproteom des Filarienparasiten Oberflächen-N-Glykoproteine ​​enthält, die für den parasitären Lebensstil spezifisch und für die Interaktionen mit dem Säugetierwirt von entscheidender Bedeutung sind.

For parasitic nematodes, the host parasite interface can be defined as the cuticle or outer exoskeleton covering of the worm, excretory-secretory (ES) components, and extracellular vesicles. Early studies of filarial worm cuticle proteins identified two B. malayi glycoproteins. gp29 (Bm2151) is a major surface glycoprotein found in the cuticle of adult worms with homology to the glutathione peroxidases that are part of the oxidative stress response22. gp15/400 (Bm6083 or Bm6084, Bma-npa-1) is a nematode polyprotein allergen related glycoprotein found in the cuticle of the adult worms and is thought to play a role in acquiring the required fatty acids that the worms cannot synthesize de novo22,23. Recently, gp15/400 was described as an immunodominant antigen targeted by human IgE monoclonal antibodies produced from parasite infected human sera24. Later studies broadened the number of cuticle associated proteins but little is known about their glycosylation status25. ES-62 (Bm9816) is a major secreted glycoprotein in filarial nematodes26,27 and of special interest due to immunomodulatory phosphorylcholine substitution of its N-glycans8,9,26. Larger proteomic studies of excreted and secreted proteins28,29, extracellular vesicle proteins30 and membrane or surface enriched proteins31 highlighted more proteins that are exposed to the mammalian host. However, the possibility of glycan-mediated interactions with the host were not addressed in these strictly proteomic analyses. N-linked glycosite mapping in Caenorhabditis elegans, a soil living nematode, identified 829 N-linked glycoproteins in one study and 1010 N-linked glycoproteins in a second21,32. These studies that identified over a thousand N-glycoproteins included all stages (egg, L1, L2, L3, L4, and adult worms) of the nematode life cycle (2015)." href="/articles/s41598-023-34936-9#ref-CR33" id="ref-link-section-d12369696e568">33. Eine aktuelle Glykosite-Kartierung eines parasitären Fadenwurms der Klasse V34, Haemonchus contortus, identifizierte 291 N-verknüpfte Glykoproteine35 nur aus einer gemischten erwachsenen Wurmprobe.

Hier nutzen und erweitern wir diese Erkenntnisse, indem wir die B. malayi-N-Glykosite von Proteinen aus Gesamtlysaten identifizieren und kartieren, die aus erwachsenen weiblichen Würmern, erwachsenen männlichen Würmern und Mikrofilarien hergestellt wurden, um das N-Glykoproteom zu charakterisieren und die Proteine ​​weiter zu erforschen Schnittstelle zwischen Filarien und Wirtsparasiten. Bezeichnenderweise zeigen wir, dass unsere Daten bekannte Beispiele für Proteine, die mit Kutikula und immunmodulatorischen Wirtsparasiten interagieren, umfassen. Wir heben auch zwei verschiedene Gruppen von N-Glykoproteinen hervor. Der erste Satz ist eine Gruppe von N-Glykoproteinen, die zehn oder mehr N-Glykosites aufweisen. Wir haben diesen Satz verwendet, um die Variation der N-Glykosit-Belegung zwischen den drei untersuchten Probentypen zu untersuchen. Der zweite Satz besteht aus einer Gruppe von N-Glykoproteinen, die nur bei erwachsenen weiblichen und erwachsenen männlichen Würmern vorkommen. Wir haben dieses Set verwendet, um Filarien- und Nematoden-spezifische Proteine ​​zu untersuchen.

Ungefähr 200 weibliche Würmer, 100 männliche Würmer oder 2 Millionen Mikrofilarien (TRS Labs Inc., Athens GA) wurden bei 10 °C in Lysepuffer (100 mM Tris HCl pH 7,5, 100 mM DTT, 4 % SDS (v/v)) resuspendiert ml pro 0,3 g nasses Wurmpellet. Um mit der Lyse zu beginnen, wurden die Proben 10 Minuten lang auf Trockeneis eingefroren und dann viermal bei 37 °C aufgetaut, bevor sie mit einem Glas-Dounce-Homogenisator homogenisiert wurden. Die homogenisierten Proben wurden dann 5 Minuten lang auf 100 °C erhitzt und dann auf Eis gekühlt. Zelltrümmer und intakte Zellen wurden 10 Minuten lang bei 15.000 × g pelletiert. Die Proteinkonzentration jedes Überstands wurde mit dem Pierce™ 660 nm Protein Assay Kit (ThermoFisher Scientific, Waltham MA) bestimmt.

Tryptische Peptide wurden wie zuvor beschrieben hergestellt36. Kurz gesagt, maximal 400 µg jedes Proteinlysats wurden unter Verwendung von Microcon 30 K-Zentrifugalfiltern (Millipore Sigma, Burlington, MA) in Harnstoffpuffer (100 mM Tris-HCl, pH 8,2, 8 M Harnstoff) gepuffert. Anschließend erfolgte die Alkylierung der Cysteinreste mit 50 mM Iodacetamid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) im gleichen Harnstoffpuffer im Dunkeln für 20 Minuten. Überschüssiges Jodacetamid wurde abgewaschen und dann wurde der Puffer erneut ausgetauscht, dieses Mal gegen 50 mM Ammoniumbicarbonat. Die Proteinmischung wurde dann mit Trypsin (P8101S, New England Biolabs, Ipswich, MA) in einem Verhältnis von Enzym zu Protein von 1:100 bei 37 °C über Nacht verdaut und die resultierenden Peptide gesammelt. Die Peptidkonzentration wurde mit dem Pierce Colorimetric Peptide Assay Quantifizierungskit bestimmt. (ThermoFisher Scientific).

N-Glykopeptide wurden wie zuvor beschrieben angereichert37. Kurz gesagt, 100 µg der gesamten Lysatpeptidmischung wurden mit 200 µg Fbs1 GYR in einem Microcon 30 K-Zentrifugalfilter gemischt und 2 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Die ungebundenen Peptide wurden durch Zentrifugation entfernt. Nach dem Waschen, um sicherzustellen, dass alle ungebundenen Peptide entfernt wurden, wurden die angereicherten N-glykosylierten Peptide mit 50 % Ameisensäure eluiert. Die Elution wurde dann lyophilisiert, um Ameisensäure und Wasser zu entfernen.

Peptide aus 100 µg der lyophilisierten Gesamtpeptidmischung (Total) oder der mit Fbs1 GYR angereicherten Peptidmischung (Fbs1) aus 100 µg Ausgangsgesamtpeptidmischung wurden in 100 mM Ammoniumbicarbonat, zubereitet mit 18O-Wasser (Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Andover, MA,) resuspendiert ). 1000 Einheiten PNGase F-Puffer (P0704, New England Biolabs), ausgetauscht in 100 mM Ammoniumbicarbonat, hergestellt mit 18O-Wasser, wurden zu einer 50-µl-Endreaktion gegeben, die entweder Gesamt- oder Fbs1-Peptidmischung enthielt. Die Reaktionen wurden 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Die Proben wurden sofort mit LC-MS/MS analysiert, wie unten angegeben, um unerwünschte chemische Desamidierungsereignisse zu vermeiden.

Peptide aus jeder der sechs Proben wurden mittels Massenspektrometrie analysiert. Für jede Probe wurden 6 % des resultierenden Peptidvolumens über einen Proxeon Easy-nLC 1000 (Thermo Scientific) auf eine Umkehrphasen-Analysesäule (Ion Opticks Aurora UHPLC-Säule, 25 cm × 75 µm ID, 1,6 µm C18) geladen. Die Säule wurde in einem Sonation Column Oven (Sonation Lab Solutions) untergebracht und bei 50 °C gehalten. Die Peptide wurden über ein dreistündiges Fenster eluiert, das aus einem 156-minütigen linearen Gradienten von 2 bis 35 % B, einem dreiminütigen Gradienten bis 85 % B und einem siebenminütigen isokratischen Fluss bei 85 % B bestand, wobei die mobile Phase A Wasser war enthaltend 0,1 % Ameisensäure und die mobile Phase B war Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure. Die eluierten Peptide wurden durch Elektrospray unter Verwendung einer Nanospray Flex-Ionenquelle (Thermo Scientific) mit einer Flussrate von 400 nL/min in ein Q Exactive-Massenspektrometer (Thermo Scientific) eingebracht. Die zehn am häufigsten vorkommenden Ionen aus jedem vollständigen Scan (70-k-Auflösung, Scanbereich 400–1600 m/z) wurden für die Fragmentierung durch HCD (Kollisionsdissoziation mit höherer Energie) ausgewählt und Fragmentierungsspektren wurden mit einer Auflösung von 35 k aufgenommen. Es wurde eine abgestufte normalisierte Kollisionsenergie von 20, 30 und 40 verwendet. Ladezustände von eins und mehr als acht wurden ausgeschlossen. Der dynamische Ausschluss wurde auf 30 s festgelegt. Jede Probe wurde mit drei technischen Replikaten analysiert und die Spektren aus jedem Dreifachsatz wurden zur Analyse kombiniert.

Spektraldaten wurden anhand des kombinierten B. malayi-Proteoms (brugia_malayi.PRJNA10729.WBPS10.protein.fa) von Wormbase38 und des Wolbachia-Endosymbionten des B. malayi-Proteoms von NCBI39 durchsucht, beide im Dezember 2019 heruntergeladen und dann mit der Byonic-Software (Protein Metrics) analysiert , Cupertino, CA). Häufige Verunreinigungen wie Keratine, Kaseine, Trypsin und BSA wurden aus der Analyse entfernt. Der Proteinausstoß wurde auf 1 % FDR eingestellt. Weitere für jeden Massenspektrometriedatensatz verwendete Parameter waren: Spaltungsstelle = RK, C-terminale Seite = semispezifisch; fehlende Spaltung = 2; Massentoleranz = 10 ppm; QTOF/HCD-Fragmentierung mit einer Fragmentmassentoleranz von 0,02 Da. Feste Modifikationen = Carbamidomethyl @ C/ + 57,021464. Variable Modifikationen = desamidiert:18O(1) / + 2,988261 @ N, Oxidation/ + 15,994915 @ M, desamidiert / + 0,984016 @ N und Q, Acetyl @Protein N-Term / + 42,010565, Gln- > Pyro-Glu/ -17,026549 , amidiert @ D und E / -0,984016. Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE40-Partner-Repository mit der Datensatz-ID PXD039002 und 10.6019/PXD039002 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt.

Wir haben die Ergebnisse so gefiltert, dass die Peptide für die mit Fbs1 angereicherten Proben einen Byonic-Score > 200 und eine Peptidlänge > 4 aufweisen mussten. Für die Gesamtproben, die eine höhere Komplexität aufwiesen, verwendeten wir einen Byonic-Score von > 300 und eine Peptidlänge > 4. Der Byonic-Score ist ein Maß für die Genauigkeit der Peptidspektrum-Übereinstimmung41. Einzelne einzigartige Peptide, die in einem Replikat der Probe nur mit einem Protein assoziiert waren und in den verbleibenden fünf Proben nicht vorhanden waren, sind in der Ergänzungstabelle S1 mit einem Sternchen gekennzeichnet und werden nicht in die weitere Datenanalyse einbezogen. Um die durch LC-MS/MS identifizierten Proteine ​​mit zuvor veröffentlichten proteomischen Studien28,29,30,31,42,43 zu vergleichen, die unterschiedliche Protein-IDs verwendeten, haben wir Querverweise auf die Datenbanken Wormbase38 und UniProt44 erstellt, um die Wormbase-ID aus unseren Daten mit den PUB_loci zu korrelieren /pub_locus-Nummern oder zur UniProtKB-ID für das B. malayi-Proteom und zur UniProt-Datenbank, um die NCBI-ID mit der UniProtKB-ID oder den wBm-Gennummern für das Wolbachia-Proteom zu korrelieren. Die Synonyme, die wir für jedes Protein in unserem für Querverweise verwendeten Datensatz gefunden haben, sind in der Ergänzungstabelle S2 aufgeführt.

We used NetNGlyc-1.046 to find the canonical N-X-S/T glycosites present in each N-glycoprotein. We used Weblogo47 to create a sequence logo for extracted -10 to + 10 amino acid sequences. We used BioVenn48 to generate a proportional Venn diagram. We used TMHMM-2.049 to predict transmembrane domains. We used UpsetR50 to generate UpsetR intersecting set plots. The gene ontology identification and functional enrichment analysis was performed using g:Profiler (version e105_eg52_p16_e84549f.) with g:SCS multiple testing correction method applying significance threshold of 0.0551. We used ggplot (2016)." href="/articles/s41598-023-34936-9#ref-CR52" id="ref-link-section-d12369696e755"> 52 zur Erstellung von Streudiagrammen aus der Analyse von Genanreicherungsdaten. Wir haben DeepLoc verwendet, um die subzelluläre Lokalisierung für jedes N-Glykoprotein vorherzusagen53. Wir haben Parasite Biomart bei Wormbase verwendet, um sowohl nach C. elegans- als auch H. contortus-Orthologen zu suchen, um B. malayi-N-Glykoproteine ​​zu identifizieren54. Wir haben Clustal Omega verwendet, um ein Mehrfachsequenz-Alignment zu erstellen55.

Die verbesserte N-Glyko-FASP-Methode verwendet eine Fbs1-GYR-Mutante, die spezifisch N-glykosylierte Peptide bindet. Dieses manipulierte Protein ist selektiv für ein breites Spektrum N-verknüpfter Glykopeptide und weist im Vergleich zum standardmäßigen N-Glyko-FASP-Protokoll, das eine Mischung aus den Lektinen ConA, WGA und RCA12037 verwendet, eine 2,2-fach höhere Anreicherung und eine geringere Verzerrung auf. Es wurde auch gezeigt, dass die Fbs1-Anreicherungsmethode besser für die N-Glykosit-Analyse geeignet ist als die weniger selektiven Methoden (HILIC oder Hydrazid), die die Anreicherung von O-verknüpften Glykanen oder anderen hydrophilen Molekülen ermöglichen37.

Wir analysierten mit PNGase F in Gegenwart von 18O-Wasser behandelte Proben sowohl aus nicht angereicherten Gesamtproteomproben (Total) als auch aus Proben nach Fbs1-Anreicherung (Fbs1) mittels LC-MS/MS für erwachsene weibliche Würmer, erwachsene männliche Würmer und Mikrofilarien. PNGase F ist eine Peptid-N-Glycosidase, die spezifisch Oligomannose, Hybridglycane und komplexe Glykane freisetzt, die an ein Asparagin gebunden sind, indem sie die Amidbindung spaltet56. Die Spaltung des Glykans mit PNGase F in 18O-Wasser führt zu einem Desamidierungsereignis, da das Asparagin unter Einbau von 18O in Asparaginsäure umgewandelt wird. Dies führt zu einer Addition von +2,98 Dalton an der primären Aminosäuresequenz des Peptids57, die durch Massenspektrometrie leicht nachgewiesen werden kann. Peptide, die ein Asparagin mit diesem Zusatz von + 2,98 Dalton enthalten, werden im Folgenden als N + 3-Peptide bezeichnet. Ohne 18O-Wasser führt die PNGase-F-Spaltung zu einer Desamidierung von +0,98 Dalton, was auch auf eine unerwünschte spontane Desamidierung von Asparagin während der Probenverarbeitung zurückzuführen sein kann. Obwohl PNGase F keine N-Glykane freisetzen kann, wenn die α (alpha) 1–3-Fucose auf dem Kern-N-Acetylglucosamin (GlcNAc) eines N-Glykans vorhanden ist, haben wir kein zweites Enzym wie PNGase A verwendet, da α (Alpha) 1-3-Fucosylierung des Kern-GlcNAc fehlt in B. malayi58 und anderen Filariennematoden59.

Der Nutzen der Fbs1-Anreicherung ist in Abb. 1a dargestellt, in der die Anzahl und der Prozentsatz der Übereinstimmungen des Peptidspektrums mit und ohne N + 3-Modifikation in jeder Probe zusammengefasst sind. Die vollständigen Daten finden Sie in der Ergänzungstabelle S1. Wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben, normalisierten wir die Eingaben, indem wir die Peptidkonzentration für alle Proben vor der Anreicherung bestimmten, um sicherzustellen, dass wir die Proben vergleichen konnten. Die Fbs1-Anreicherung verbessert sowohl die Gesamtzahl der N-glykosylierten Peptide als auch die Qualität der Daten. Ohne Anreicherung ist die Anzahl der N+3-Peptide in den Gesamtproben auf 1 % bis 3 % aller Peptide begrenzt. Selbst wenn in den Gesamtproben Zehntausende Peptide identifiziert wurden, liegt die endgültige Anzahl der identifizierten N + 3-Peptide zwischen 45 und 241, wobei in der Probe des männlichen Wurms die geringste Zahl vorhanden war. Im Gegensatz dazu weisen die mit Fbs1 angereicherten Proben 213 bis 1366 N+3-Peptide auf, was einer vier- bis fünffachen Steigerung der verfügbaren N+3-Peptiddaten im Vergleich zu den Gesamtproben entspricht. Um die N + 3-Peptide als N-Glykosite zu definieren, benötigten wir außerdem ein kanonisches N-Glykosylierungsstellenmotiv, NXS/T, wobei X eine beliebige andere Aminosäure als Prolin sein könnte21. (Die NXS/T-Sequenz wird im Folgenden als kanonische N-Glykosite bezeichnet und ein N + 3-Peptid mit einer kanonischen N-Glykosylierungsstelle wird als identifizierte N-Glykosite bezeichnet. Spezifische identifizierte N-Glykosite werden mit aufgeführt die Position des Asparagins in der Aminosäuresequenz, gefolgt von seiner NXS/T-Sequenz, z. B. 67 NET. Um eine identifizierte N-Glykosit zu sein, wurden alle N + 3-Peptide daraufhin bewertet, ob sie eine kanonische N-Glykosit enthalten, und werden notiert in Abb. 1a in Orange. Diese Ergebnisse veranschaulichen die Leistungsfähigkeit und den Nutzen der Fbs1-Anreicherungsmethode bei der Identifizierung von N-Glykositen, da in den mit Fbs1 angereicherten Proben eine hohe Übereinstimmung der N + 3-Modifikation mit einem kanonischen N-Glykosit besteht. In den drei Fbs1-Proben weisen 74–87 % aller Peptide in der Probe eine N + 3-Modifikation auf einem kanonischen N-Glykosit auf. Abbildung 1c konzentriert sich auf Peptide mit N + 3-Modifikation und zeigt, dass der Prozentsatz an N + 3-modifizierten Peptiden mit einem kanonischen N-Glykosit in Fbs1-Proben 98–99 % beträgt. Bei den Gesamtstichproben mit höherer Stichprobenkomplexität ist die Konkordanz wesentlich geringer. Erwartungsgemäß weisen nur 0,7 % bis 1,6 % aller Peptide in diesen nicht angereicherten Proben eine N + 3-Modifikation auf einem kanonischen N-Glykosit auf (Abb. 1a). Selbst wenn jedoch nur Peptide mit einer N + 3-Modifikation analysiert werden, werden nur 51–84 % der N + 3-modifizierten Peptide in den Gesamtproben mit einem kanonischen N-Glykosit gefunden (Abb. 1c). Dieser größere Hintergrund besteht trotz eines höheren Byonic-Score-Schwellenwerts für die Peptide aus den Gesamtproben, der zur Erhöhung der Stringenz verwendet wird. Folglich erhöht die Anreicherung von Peptiden durch Fbs1 sowohl die Anzahl der identifizierten N-Glykosites als auch den Hintergrund.

Fbs1-Anreicherung. Jeder Balken stellt den Mittelwert der Peptidspektrum-Übereinstimmungen in (a) oder den Mittelwert der identifizierten Proteine ​​in (b) sowohl der Gesamtproben (keine Anreicherung) als auch der mit Fbs1 angereicherten Proben für weibliche Würmer ♀, männliche Würmer ♂ und Mikrofilarien dar, Mf. In hellgrau, mit der Bezeichnung Non N + 3, sind die Peptide oder Proteine ​​ohne die N + 3-Modifikation dargestellt. In Dunkelgrau, mit der Bezeichnung N + 3: Andere, sind die nichtkanonischen N + 3 enthaltenden Peptide oder Proteine ​​ohne NXS/T-Glykosit. Orange markiert mit N + 3: NXS/T sind die N-Glykosit-Peptide oder -Proteine ​​mit sowohl einer N + 3-Modifikation als auch einem damit verbundenen kanonischen NXS/T-Glykosit. Der dunkelgraue Prozentsatz neben dem Balken stellt den N + 3: Anderen Prozentsatz in der gesamten Stichprobe dar. Der orangefarbene Prozentsatz neben dem Balken stellt die N + 3: NXS/T-Peptide oder Proteine ​​in der gesamten Probe dar. Die Kreisdiagramme stellen den Prozentsatz von Anderen vs. NXS/T für die N + 3 Peptide in (c) oder N + 3 Peptide enthaltenden Proteine ​​in (d) dar.

Die Ergebnisse der Fbs1-Anreicherung spiegeln sich wider, wenn man die Ergebnisse auf Proteinebene betrachtet. Proteine, die durch ein einzelnes einzigartiges Peptid in nur einem Replikat der sechs Proben identifiziert wurden, wurden von unserer Analyse ausgeschlossen (Ergänzungstabelle S1, * Einzelne Peptide). In den mit Fbs1 angereicherten Proben hatte ein höherer Prozentsatz an Proteinen eine N + 3-Modifikation und lag zwischen 78 und 88 %, wie in Abb. 1b dargestellt. Im Gegensatz dazu wurde in den Gesamtproben die N+3-Modifikation nur in 4 % der männlichen Wurmproteine ​​und 13–18 % der weiblichen Wurm- und Mikrofilarienproteine ​​gefunden. Für die Gesamtproben zeigt Abb. 1d, dass es eine relativ ähnliche Anzahl von N + 3-Peptid-haltigen Proteinen ohne kanonische N-Glykosit gab wie mit einer NXS/T-Sequenz. Bei der Fbs1-Anreicherung wiesen nur 1–6 % der Proteine ​​N + 3-Peptide ohne kanonische N-Glykosite auf. Dies führt dazu, dass in Fbs1-angereicherten Proben vier- bis fünfmal mehr N-glykosylierte Proteine ​​identifiziert werden als in Gesamtproben oder nicht angereicherten Proben mit äquivalenten analysierten Eingangsmengen.

Insgesamt wurden in den sechs analysierten Proben über 2000 verschiedene Proteine ​​identifiziert (Ergänzungstabelle S2). Nachdem wir alle Proteine ​​mit einer N + 3-Modifikation extrahiert hatten und eine kanonische N-Glykosite benötigten, identifizierten wir 582 N-glykosylierte Proteine ​​mit 1273 N-verknüpften Glykositen (Ergänzungstabelle S3). Es ist zu beachten, dass diese Daten aus technischen Replikaten einer gepoolten Probe weiblicher, männlicher Würmer und Mikrofilarien generiert wurden. Im Vergleich dazu glauben wir, dass es sich bei den über 1000 N-Glykoproteinen in den N-Glykoproteomen von C. elegans21,32, die alle Lebensstadien umfassen, und im N-Glykoproteom von H. contortus mit 282 N-Glykoproteinen35, die Proben erwachsener Würmer darstellen, um B. malayi N -Glykoproteom aus erwachsenen Wurm- und Mikrofilarienproben liefert eine gute Momentaufnahme des Filarien-N-Glykoproteoms, das im Säugetierwirtsstadium vorhanden ist.

Wie bei anderen untersuchten N-Glykoproteomen üblich, begünstigte die Verteilung der N-Glykosite NXT mit 791 Stellen (62 %) im Vergleich zu NXS mit 482 Stellen (38 %)21. Wir extrahierten die Sequenzen 10 Aminosäuren stromaufwärts und stromabwärts der identifizierten N-Glykosite, um nach zusätzlichen konservierten Motiven zu suchen (Ergänzungstabelle S3, Ergänzungsabbildung S1). Die Daten zeigten das erwartete NXS/T, wobei X eine beliebige Aminosäure außer Prolin und keine zusätzlichen Motive sein könnte. In den Proben wurden Proteine ​​des Wolbachia-Endosymbionten gefunden, aber erwartungsgemäß konnten wir keines davon als N-Glykoproteine ​​identifizieren (Ergänzungstabelle S2).

53 % der N-Glykoproteine ​​haben eine N-verknüpfte Glykosite, während der Rest zwei oder mehr N-verknüpfte Glykositen aufweist (Abb. 2a). Acht Proteine ​​hatten zehn oder mehr N-verknüpfte Glykosites und sind in Tabelle 1 aufgeführt. Diese hochglykosylierten Proteine ​​zeigen die erhöhte Anzahl von N-Glykosites, die mithilfe der Fbs1-Anreicherung entdeckt werden können. Für alle acht Proteine ​​wurden in den Fbs1-Proben mehr N-Glykosite identifiziert als in den Gesamtproben. Obwohl die erhöhte Anzahl von N-Glykositen, die durch die Fbs1-Anreicherung aufgedeckt werden, bei stark glykosylierten Proteinen deutlich erkennbar ist, bleibt dieser Trend bei den meisten N-Glykoproteinen derselbe. Tatsächlich wurden nur 33 oder 2,6 % der 1273 N-Glykosite ausschließlich in Gesamtproben gefunden, nicht jedoch in Fbs1-Proben. Diese wenigen Proteine ​​sind in den Probenspalten der Ergänzungstabelle S3 mit einem Sternchen gekennzeichnet.

N-Glykoproteine ​​(a) Die Verteilung von N-Glykoproteinen mit 1 bis 10 + N-Glykositen. (b) Flächenproportionaler Venn-Diagramm-Überlappungsvergleich der 582 identifizierten N-Glykoproteine ​​aus standardisierten Mengen weiblicher, männlicher und Mikrofilarien von B. malayi-Würmern, die in dieser Studie analysiert wurden.

Ein weiteres bemerkenswertes Merkmal in Tabelle 1 ist die Variabilität der N-Glykosit-Belegung zwischen den Proben. Die insgesamt identifizierten N-Glykosite aller sechs Proben sind in der 6. Spalte mit der Bezeichnung „Alle“ aufgeführt. Ein Vergleich dieser Gesamtmenge mit den in den einzelnen Proben gefundenen N-Glykositen zeigt die Variation der N-Glykositen zwischen diesen Proben. Für zwei Proteine, Bm2376a und Bm6131, stimmt die Gesamtzahl der identifizierten N-Glykosite mit der Gesamtzahl der in Mikrofilarien gefundenen überein. Eine kleinere Untergruppe dieser N-Glykosite kommt jedoch in erwachsenen männlichen und erwachsenen weiblichen Würmern vor. Bei den anderen sechs Proteinen liegt eine Mischung aus einzelnen und überlappenden N-Glykositen vor, die in der Summe die Gesamtzahl aller Proben ergeben.

Abbildung 3 veranschaulicht die Variabilität der N-Glykositbelegung für Bm7191. Es wird vorhergesagt, dass es sich bei diesem Protein um ein Membranprotein handelt, bei dem die ersten 604 Aminosäuren des Proteins außerhalb der Membran ausgerichtet sind und eine einzelne Transmembranregion von 605 bis 627 grau hervorgehoben ist60. Es verfügt über 22 kanonische N-Glykosite, die sich alle innerhalb der Region befinden, die voraussichtlich außerhalb der Membran liegt46. Während insgesamt 12 N-Glykosite identifiziert wurden, zeigt die Kartierung der Proteinsequenz, dass bei weiblichen Würmern, männlichen Würmern und Mikrofilarien nur eine Stelle bei 67 NET besetzt ist. In Mikrofilarien sind zwei N-Glykosite bei 26 NGS und 145 NKT eindeutig besetzt und in weiblichen Würmern sind zwei weitere N-Glykosite bei 120 NFT und 443 NDS eindeutig besetzt. Die restlichen sieben Standorte sind sowohl mit weiblichen Würmern als auch mit Mikrofilarien besetzt. Zwei Standorte bei 345 NAS und 443 NDS lagen unter dem festgelegten Schwellenwert für die N-Glykosite-Vorhersage, wurden jedoch als N-Glykosite identifiziert, was zeigt, dass der Schwellenwert für die N-Glykosite-Vorhersage in einigen Fällen möglicherweise gesenkt werden muss. Die Variabilität der N-Glykosit-Belegung muss weiter untersucht werden, um ihre biologische Bedeutung zu bestimmen.

N-Glykosit-Belegung von Bm7191: Die vollständige Proteinsequenz von Bm7191 ist dargestellt, wobei die vorhergesagte Transmembranregion grau hervorgehoben ist49. NXS/T-Stellen werden in der Proteinsequenz blau gefärbt, wenn sie als N-Glykosit vorhergesagt werden, und rot gefärbt, wenn der durch die Jury-Übereinstimmung unter Verwendung von neun neuronalen Netzen festgelegte Schwellenwert nicht erreicht wurde und eine höhere Bewertung als der von NetNGlyc-1.046 festgelegte Schwellenwert erreicht wurde. N-Glykosite, die in weiblichen Würmern (rot gefärbt ♀), männlichen Würmern (grün gefärbt ♂) und Mikrofilarien (blau gefärbt mf) vorkommen, sind oberhalb der Sequenz angegeben.

Die Überlappung von Proteinen, die bei Männern, Frauen und Mikrofilarien als N-glykosyliert beobachtet wurden, ist in Abb. 2b dargestellt. Während in allen drei Proben 81 bzw. 14 % der Proteine ​​N-glykosyliert vorliegen, ist in einer der drei Proben fast die Hälfte der Proteine ​​(32 % bei Mikrofilarien, 12 % bei Frauen und 3 % bei Männern) nur N-glykosyliert . Die größte Überlappung von 34 % aller N-Glykoproteine ​​besteht zwischen den weiblichen Wurm- und Mikrofilarienproben. Diese Überlappung wird wahrscheinlich durch die intrauterinen Mikrofilarien, die in weiblichen Würmern vorhanden sind, verfälscht und sollte im Auge behalten werden, wenn spezifische N-Glykosites gemeinsam zwischen weiblichen und Mikrofilarien in einzelnen N-Glykoproteinen gefunden werden. Von den drei hier untersuchten Probentypen weisen Mikrofilarien mit 477 die größte Anzahl an N-Glykoproteinen und mit 188 die einzigartigsten N-Glykoproteine ​​auf. Dies könnte daran liegen, dass Mikrofilarien dem Immunsystem entkommen müssen, während sie von den Lymphgefäßen in den peripheren Kreislauf wandern entwickeln sich anschließend innerhalb eines Mückenvektors weiter. Männliche Würmer haben die wenigsten N-Glykoproteine ​​sowie die geringsten N-Glykosite (Tabelle 1, Abb. 1a,c). Es ist nicht klar, was für diesen beobachteten geringeren N-Glykosylierungsgrad verantwortlich ist. Dennoch gibt es 17 N-Glykoproteine ​​männlicher Würmer, die weder in den Gesamt- noch in den Fbs1-Proben von erwachsenen weiblichen Würmern oder Mikrofilarien N-glykosyliert gefunden werden.

Beim Vergleich der 582 N-verknüpften glykosylierten Proteine ​​mit zuvor veröffentlichten B. malayi-Proteomen stellten wir fest, dass 111 Proteine ​​(19 %) zuvor in keiner Proteomstudie identifiziert worden waren (Abb. 4, Keine Übereinstimmung). Dies zeigt die Leistungsfähigkeit der Fbs1-Anreicherung, das Proteom nach Proteinen mit geringer Häufigkeit oder schwer zu findenden Proteinen zu durchsuchen. Unsere Identifizierung N-glykosylierter Proteine ​​fügt auch Kontext zu den zuvor veröffentlichten Proteomen hinzu; Wir haben 471 zuvor gemeldeten Proteinen den Glykosylierungsstatus hinzugefügt. Beispielsweise überlappten 136 N-Glykoproteine ​​mit exkretorischen sekretorischen Proteomen und 188 mit einem Membranproteom. Diese Informationen können uns helfen zu verstehen, wo diese N-Glykoproteine ​​gefunden werden und in welchem ​​Stadium sie im Wurm vorhanden sind.

UpSetR-Datenanalyse identifizierter B. malayi-N-Glykoproteine ​​mit zuvor veröffentlichten B. malayi-Proteomen: EV 201830 ist das extrazelluläre Vesikel-Proteom. ES 200829 und ES 200928 sind die exkretorischen und sekretorischen Proteomsätze. Membran. 201931 sind die Oberflächen- und Membranproteomsätze; BDR 201542 ist ein Proteom der Körperwand, des Verdauungstrakts und des Fortpflanzungstrakts. SS 201143 sind die stadienspezifischen Proteom-Sets. „Keine Übereinstimmung“ weist darauf hin, dass identifizierte N-Glykoproteine ​​in diesen sechs Proteomstudien nicht gefunden wurden. Die links angezeigte Satzgröße gibt die Anzahl der Proteine ​​in jedem Satz an. Die Balken über den einzelnen Punkten zeigen die Anzahl der N-glykosylierten Proteine, die für dieses Proteom einzigartig sind. Die Balken über den mehreren verbundenen Punkten zeigen die Anzahl der N-glykosylierten Proteine, die diese Proteome gemeinsam haben50.

Um Genanreicherungsdaten zu analysieren und Funktions- und Lokalisierungsinformationen zu untersuchen, wurde eine Annotation der Genontologiedaten für die N-glykosylierten Proteine ​​erstellt und eine Genanreicherungsanalyse mit g:Profiler51 durchgeführt (Ergänzungstabelle S4, Abb. 5a). Während etwa ein Drittel oder 179 der N-verknüpften Glykoproteine ​​fehlten, wiesen 403 N-verknüpfte Glykoproteine ​​einige Annotationen zur Genontologie oder Informationen zum KEGG-Signalweg45 auf. Dazu gehörte die Annotation der Zellkomponenten für 329 oder 57 % der N-Glykoproteine, wobei die Anreicherungsanalyse zeigt, dass Proteine, die mit Membranen assoziiert sind, extrazelluläre Proteine ​​oder Zelloberflächenproteine ​​überrepräsentiert sind; Annotation zu biologischen Prozessen für 148 oder 25 % der N-Glykoproteine ​​und Annotation zur molekularen Funktion für 123 oder 21 % der N-Glykoproteine, wobei Proteine, die an Proteolyse, Glykosylierung und Adhäsion beteiligt sind, überrepräsentiert sind. Ebenso sind die für die Glykosylierung und den Proteinabbau wichtigen KEGG-Signalwege45 überrepräsentiert. Wie für N-glykosylierte Proteine ​​erwartet, bestätigt dies, dass diese Proteine ​​Eigenschaften aufweisen, die man von Proteinen erwartet, die mit Wirtsparasiten interagieren.

Genontologie und subzelluläre Lokalisierungsvorhersage und -analyse (a): Streudiagramme veranschaulichen angereicherte GO-Begriffe und KEGG-Datenbankpfade. Die vertikale Achse stellt die angereicherten Begriffe in jeder Kategorie dar, und die horizontale Achse stellt den Anreicherungs-p-Wert dar. Der p-Wert wurde auf 16 begrenzt, wie durch die dunkle vertikale gestrichelte Linie dargestellt. Die Größe der Punkte zeigt die Gennummer und die Farbe den Probentyp. Der GO:BP-Satz sind die wichtigsten Genontologiebegriffe für biologische Prozesse, der GO:CC-Satz sind die wichtigsten Genontologiebegriffe für Zellkomponenten, GO:MF sind die wichtigsten Genontologiebegriffe für molekulare Funktionen und der KEGG-Satz sind die wichtigsten KEGG-Pfade (b): Das proportionale Balkendiagramm zeigt die Anzahl der N-Glykoproteine ​​an zehn verschiedenen subzellulären Stellen an, wobei Orange die vorhergesagten Membranproteine ​​und Grau die löslichen Proteine ​​anzeigt.

Darüber hinaus haben wir DeepLoc-1.0 verwendet, das einen sequenzbasierten Algorithmus verwendet, um die subzelluläre Lokalisierung vorherzusagen53. Diese Anmerkung erweiterte die subzellulären Lokalisierungsvorhersagen auf alle 582 Proteine ​​(Ergänzungstabelle S5). Schätzungen zufolge sind mehr als 50 % der Proteine ​​Membranproteine ​​und werden hauptsächlich in Zellmembran, endoplasmatisches Retikulum, Golgi und Lysosom/Vakuole unterteilt (Abb. 5b). Von den verbleibenden 278 N-Glykoproteinen, von denen vorhergesagt wurde, dass sie lösliche Proteine ​​sind, wird geschätzt, dass etwa die Hälfte extrazelluläre Proteine ​​sind. Genontologie, subzelluläre Lokalisierungsvorhersagen und die Informationen aus früheren proteomischen Studien helfen dabei, N-Glykoproteine ​​auf ihre potenziellen Wirt-Parasit-Interaktionen hin zu untersuchen.

Die beiden zuvor erwähnten Kutikulaproteine, gp29, eine wahrscheinliche Glutathionperoxidase, und gp15/400, ein Nematoden-Polyprotein-Allergen-verwandtes Protein, sind in allen analysierten Proben vorhanden. Die Glykositkartierung von gp29 (Bm2151a) weist auf eine variable N-Glykosylierung hin; In weiblichen Wurmproben, in denen dieses Protein reichlich vorhanden ist (40 einzigartige Peptide in der Gesamtprobe und 36 einzigartige Peptide in der Fbs1-Probe), werden beide kanonischen N-Glykosite46 bei 39 NQT und 92 NGT sowohl in den Gesamt- als auch in den Fbs1-Proben glykosyliert, während in männlichen Würmern ( 8 einzigartige Peptide in der Gesamtprobe und 4 einzigartige Peptide in der Fbs1-Probe), Peptide sowohl in der Gesamtprobe als auch in der Fbs1-Probe zeigen, dass nur Stelle 39 glykosyliert ist und in Mikrofilarien (4 einzigartige Peptide in der Gesamtprobe und 2 einzigartige Peptide in der Fbs1-Probe) Peptide in der Fbs1-Probe zeigen, dass nur Stelle 92 glykosyliert ist. Da keine aglykosylierten Peptide identifiziert wurden, die Stelle 92 in männlichen Gesamtproben oder Stelle 39 in Mikrofilarien-Gesamtproben überlappen, können wir das Fehlen einer Glykosylierung nicht schlüssig bestätigen, würden aber davon ausgehen, dass die Fbs1-Anreicherung diese Peptide angereichert hätte, wenn sie N-glykosyliert worden wären. Wie bereits erwähnt, können wir in weiblichen Proben nicht unterscheiden, ob das N-Glykosit nur im weiblichen Gewebe, in intrauterinen Mikrofilarien oder in beiden vorhanden ist. In diesem Fall könnte also die Stelle 92 in der weiblichen Probe auf die intrauterine Mikrofilarie zurückzuführen sein. Mit 58 eindeutigen Peptiden, die bei Frauen insgesamt, 26 einzigartigen Peptiden bei Männern insgesamt und 17 einzigartigen Peptiden bei Mikrofilarien insgesamt identifiziert wurden, ist gp15/400 (Bm6084) ein relativ häufig vorkommendes Kutikulaprotein. Es wird berichtet, dass es Lipide bindet und über 16 mehrfache Tandemwiederholungen einer nematodenspezifischen Domäne ABA-122,23 verfügt, die eine einzelne kanonische N-Glykosit innerhalb der Wiederholungsdomäne enthält. Unsere Daten zeigen, dass dieses NLT-Glykosit in weiblichen und Mikrofilarien-Proben sowohl aglykosyliert als auch glykosyliert und in männlichen Proben glykosyliert vorkommt. Aufgrund der Tandem-Wiederholungen können wir jedoch nicht bestimmen, wie viele dieser 16 wiederholten N-Glykosite besetzt sind. Darüber hinaus verfügt gp15/400 über 8 weitere kanonische N-Glykosite46, die nicht in den Tandemwiederholungen lokalisiert sind. Vier dieser Stellen bei 139 NDS, 359 NGS, 527 NVT und 2867 NHS sind bei weiblichen Würmern glykosyliert, während drei Stellen bei den Positionen 139, 359 und 527 bei Mikrofilarien glykosyliert sind und nur zwei bei 527 und 2867 bei männlichen Würmern glykosyliert sind. Im Gegensatz dazu weist das Ortholog von C. elegans, npa-1, mit einem RNAi-Phänotyp mit verlängerter Lebensdauer61 Tandemwiederholungen, aber keine kanonischen N-Glykosite46 auf, was die Möglichkeit eröffnet, dass die N-Glykosylierung von gp15/400 in B. malayi eine spezielle Rolle spielt.

Wir haben auch andere von Page et al. identifizierte Kutikulaproteine ​​überprüft. als potenzielle Ziele für die Biosynthese und Häutung der Kutikula25 und heben drei zusätzliche Kutikula-N-Glykoproteine ​​hervor. Erstens wurde durch RNAi-Studien in B. malayi62 gezeigt, dass Bma-PHY-1 (Bm3843) für die Entwicklung der Kutikula wichtig ist. Es ist ein Ortholog von C. elegans dpy-18, einer Prolyl-4-hydroxylase-α-Untereinheit, die für die Kollagenbiosynthese wichtig ist63,64. Es wurde auch gezeigt, dass C. elegans dpy-18 N-glykosyliert ist, wenn auch an einer anderen Glykosit21. Peptide für Bma-PHY-1 wurden in Proben von Frauen, Männern und Mikrofilarien gefunden, aber von zwei möglichen kanonischen N-Glykositen wurden glykosylierte Peptide nur für die Glykosit bei 157 NAS und nur in Proben von Frauen und Mikrofilarien gefunden. Zweitens ist Bm-MLT-7 (Bm7474) ein Ortholog von C. elegans mlt-7, das einen RNAi-Phänotyp der frühen Larvenletalität aufweist. Es wird vorausgesagt, dass es Häm-bindende Aktivität und essentielle Peroxidase-Aktivität aufweist, die für die Synthese und Häutung der Kutikula wichtig sind65, und es wurde gezeigt, dass es an beiden im Protein vorhandenen kanonischen N-Glykosylierungsstellen N-glykosyliert ist21. In unseren Daten wurden Peptide für Bm-MLT-7 in weiblichen, männlichen und Mikrofilarienproben gefunden, und während beide kanonischen N-Glykosite bei 95 NST und 477 NIS in weiblichen Proben N-glykosyliert waren, war in Mikrofilarien nur 95 N-glykosyliert . Drittens wird angenommen, dass Bm-CPZ-1 (Bm3754) eine Cathepsin-basierte Cysteinprotease ist, die für die Ecdyse, die Kutikulaentwicklung und die postembryonale Körpermorphogenese mit RNAi-Phänotyp in B. malayi mit verringerter Freisetzung von Mikrofilarien wichtig ist66. Seine Orthologen, C. elegans cpz-1 und O. volvulus cpz-1, weisen RNAi-Phänotypen auf, die Häutungsdefekte zeigen67,68. Es wurde gezeigt, dass C. elegans cpz-1 an einer Stelle N-glykosyliert ist21. In unseren Daten wurde dieses Protein in allen drei Datensätzen gefunden und N-glykosylierte Peptide für die einzige kanonische N-Glykosite bei 187 NYT wurden in weiblichen Würmern und Mikrofilarien gefunden. Obwohl es keine Bestätigung durch aglykosylierte Peptide gibt, verstärkt das in männlichen Fbs1-Proben gefundene Fehlen einer N-Glykosylierung für diese drei Kutikulaproteine ​​sowohl den beobachteten niedrigeren Glykosylierungsgrad bei männlichen Würmern als auch die Variabilität der N-Glykosylierung von Proteinen zwischen männlichen und weiblichen Würmern und Mikrofilarien.

Frühere Studien haben ES-62, Bm-mif-1, Serpin und BmVal1 als wichtige Proteine ​​identifiziert, die das Immunsystem des Wirts modulieren28. ES-62 (Bm9816) ist eine vorhergesagte Leucylaminopeptidase mit immunmodulatorischer Aktivität des Wirts, die mit dem Phosphorylcholin auf ihren N-Glykanen verknüpft wurde27,28. Kürzlich wurde der N-Glykosylierungszustand von A. viteae ES-62 aus gemischten adulten Proben charakterisiert und zeigte sowohl Heterogenität der PC-haltigen Glykane als auch Unterschiede in der Stellenbelegung an den vier N-Glykosylierungsstellen des Proteins19. Während A. viteae ES-62 und Bm9816 laut BlastP39 zu 71 % identisch sind, überlappen sich ihre N-Glykosite nicht, was zeigt, dass sich die N-Glykosite auch bei Proteinen mit einem hohen Maß an Identität unterscheiden können. In unseren Daten kommt Bm9816 in allen drei Datensätzen vor, aber während es in der weiblichen Probe (20 einzigartige Peptide in der Gesamtprobe) und in der Mikrofilarienprobe (17 einzigartige Peptide in der Gesamtprobe) relativ häufig vorkommt, wurde in der weiblichen Probe nur ein einzigartiges Peptid identifiziert männliche Probe. N-glykosylierte Peptide für 4 N-Glykosites bei 30 NDT, 128 NIT, 146 NVS, 241 NHT wurden für ES-62 in den weiblichen und mikrofilarialen Proben von möglichen 6 kanonischen N-Glykositen im Protein gefunden. Das N-Glykosit bei 241 NHT ist einer der wenigen Fälle, in denen ein N-Glykosit sowohl in der weiblichen Gesamtprobe als auch in der Mikrofilaria-Gesamtprobe vorhanden war, jedoch nicht in einer der Fbs1-Proben. In der männlichen Probe wurden keine glykosylierten Peptide identifiziert. Bm-mif-1 (Bm6870) ist ein von Filarien sezernierter Makrophagenmigrationshemmfaktor und erwies sich als Hauptantigen einer parasitären Wurminfektion24,69. Dieses Protein kommt in Gesamtproben relativ häufig vor (19, 8, 22 einzigartige Peptide bei Frauen, Männern und Mikrofilarien), wurde jedoch in Fbs1-angereicherten Proben nicht gefunden, was darauf hindeutet, dass Bm-mif-1 zumindest bei erwachsenen Würmern und Mikrofilarien nicht vorkommt N-glykosyliert, obwohl es zwei kanonische N-Glykosite aufweist. Es kann sein, dass es in einem anderen Lebensstadium oder unter Bedingungen, die hier nicht untersucht wurden, N-glykosyliert wird. Serpin (Bm9380) ist ein mikrofilarieller Serinproteaseinhibitor, der vermutlich auf Enzyme menschlicher Neutrophilen wirkt70. Wie erwartet wurden Peptide von Serpin nicht in den weiblichen oder männlichen Datensätzen gefunden, waren jedoch sowohl in mikrofilariellen Gesamtproben als auch in mit Fbs1 angereicherten Proben vorhanden, wobei N-Glykosylierung an beiden kanonischen N-Glykositen, 21 NST und 266 NSS, identifiziert wurde. Es hat sich gezeigt, dass BmVal1 (Bm4233b) ein wichtiges Protein bei Interaktionen mit Wirtsparasiten ist und eine starke Wirtsantikörperreaktion aufweist71. Außerdem wurde in einer kürzlich durchgeführten räumlichen Transkriptomstudie von B. malayi BmVal1 unter den Gentranskripten weiblicher kopfangereicherter Gene identifiziert, die für das Nahrungsaufnahme-, Sinnes-, Sekretions- und Fortpflanzungsverhalten wichtig sind, und ist daher ein vielversprechendes Ziel für erwachsene Würmer, die mit Medikamenten behandelt werden können72. Das BmVal1-Glykoprotein verfügt über zwei kanonische N-Glykosites und wurde rekombinant in Pflanzenzellen hergestellt, wobei beide Stellen glykosyliert waren, und seine Proteinstruktur wurde bestimmt71. In unserer Studie wurden beide N-Glykositen bei 52 NGT und 138 NLT in den weiblichen und mikrofilarialen Proben glykosyliert, während in den männlichen Proben nur Daten vorlagen, die bestätigten, dass die zweite Stelle bei 138 glykosyliert ist.

Bm5654 ist ein Ortholog einer Aminopeptidase (Antigen H11), die nachweislich ein wichtiger Bestandteil eines immunprotektiven Extrakts in H. contortus73,74 ist. Dieser Schutz wurde mit der N-Glykosylierung in Verbindung gebracht74. Bm5654 kommt in allen drei Datensätzen vor und ist in der weiblichen Probe (43 einzigartige Peptide in der Gesamtprobe) und in der männlichen Probe (12 einzigartige Peptide in der Gesamtprobe) reichlich vorhanden, in der Mikrofilarien-Gesamtprobe wurde jedoch nur ein einzigartiges Peptid identifiziert. N-glykosylierte Peptide für 8 N-Glykosite wurden in den weiblichen Proben von möglichen 15 kanonischen N-Glykosites gefunden, die im Protein bei 83 NVS, 115 NLT, 133 NMT, 265 NET, 419 NQT, 440 NIS, 789 NLT vorhanden waren. und 970 NDS. In männlichen Proben wurde nur ein N-Glykosit bei 970 identifiziert. Auch wenn es in Mikrofilarienproben weniger häufig vorkommt, zeigte die Fbs1-Anreicherung, dass dieses Protein an 6 N-Glykosylierungsstellen N-glykosyliert war, darunter eine bei 241 NIT, die in weiblichen Proben nicht gefunden wurde. Der Abgleich von Bm5654 mit seinem H. contortus-Ortholog (41 % Identität) mithilfe von BlastP39 zeigt, dass nur das letzte der 8 identifizierten N-Glykosite bei 970 gemeinsam genutzt wird und NSS im H. contortus-Antigen H11 ist.

Um die Proteine ​​adulter Parasiten zu untersuchen und Proteine ​​zu vermeiden, die aufgrund intrauteriner Mikrofilarien in weiblichen Proben auftreten können, haben wir uns auf die 15 N-Glykoproteine ​​konzentriert, die sowohl bei weiblichen als auch bei männlichen Würmern N-glykosyliert sind, aber weder in mikrofilariellen Gesamt- noch in Fbs1-Proben identifizierte Peptide aufweisen (Abb. 2b, Tabelle 2). Da es sich bei diesen Proben um Lysate ganzer Würmer handelte, ist es nicht möglich, die teilweise Belegung einer N-Glykosite als gewebespezifische N-Glykosylierung oder das Vorhandensein von zwei unterschiedlich glykosylierten Proteinen im selben Gewebe zu unterscheiden.

Bm14109 ist ein Beispiel für ein relativ häufig vorkommendes Protein (98 einzigartige Peptide in der weiblichen Gesamtzahl und 47 einzigartige Peptide in der männlichen Gesamtzahl) mit variablen N-Glykosylierungsmustern, die in erwachsenen männlichen und erwachsenen weiblichen Würmern vorkommen, jedoch nicht in Mikrofilarien. Dieses Protein ist ein Lipidtransporterprotein, das auf der Genontologie basiert. In früheren proteomischen Studien wurde es in extrazellulären Vesikeln erwachsener Frauen 30, Oberflächenproben erwachsener Würmer31 und Membranproben31 gefunden, was auf eine mögliche Wechselwirkung zwischen Wirt und Parasit schließen lässt. Dies wird durch eine kürzlich durchgeführte räumliche Transkriptomstudie untermauert, bei der es im Kopf, einer mit Medikamenten behandelbaren Schnittstelle zwischen Wirt und Parasit, sowie im Darm angereichert wird, wo Arzneimittel- und Impfstoffkandidaten aus „verborgenen Antigenen“, die auf den Verdauungskanal beschränkt sind, vorhanden sind72. In unserer Studie wurden acht von zwölf kanonischen N-verknüpften Glykositen in weiblichen erwachsenen Würmern an den Standorten 131 NNT, 548 NET, 634 NFT, 1187 NRT, 1524 NAT, 1638 NLT, 1692 NLS und 1840 NES identifiziert, wobei sich die Stelle an der Position befand 1840 fanden sich auch in weiblichen und männlichen Gesamtproben aglykosylierte Substanzen. Da die N-Glykosylierung zwischen weiblichen und männlichen Würmern unterschiedlich ist, wurde in männlichen Proben nur ein N-Glykosit an Position 1897 NKT als glykosyliert gefunden. Die einzigen durch das NCBI-Protein Blast39 identifizierten Orthologen zu Bm14109 befinden sich in der Spirurina75-Unterordnung der Nematoden oder innerhalb der Clade III der parasitären Nematoden34. Tabelle 3 zeigt die Taxonomie von Brugia malayi, wie in NCBI75 aufgeführt. Das Vorkommen dieses Proteins an der Schnittstelle zwischen Wirt und Parasit und in einer überwiegend parasitischen Nematoden-Unterordnung weist darauf hin, dass dieses Glykoprotein eine hochspezialisierte Rolle spielen könnte.

Bm10521, Bm10329 und Bm10905 sind zusätzliche Glykoproteine, deren Orthologe auf die Spirurina-Unterordnung der Nematoden beschränkt sind. Diese Glykoproteine ​​kommen in unseren Mikrofilarienproben nicht vor, sind aber in erwachsenen weiblichen und männlichen Würmern vorhanden. Darüber hinaus zeigen transkriptomische Daten, dass Bm10521-Transkripte auf erwachsene Würmer beschränkt sind und Bm10329- und Bm10905-Transkripte bei erwachsenen Würmern häufiger vorkommen76,77. Das Bm10521-Protein befindet sich voraussichtlich in der Membran, ist jedoch ansonsten nicht charakterisiert. Unsere Daten zeigen, dass es bei männlichen Würmern an zwei von acht kanonischen N-Glykositen bei 479 NSS und 806 NDT glykosyliert ist, während es bei weiblichen Würmern nur an einer einzigen anderen N-Glykosit bei 749 NDS glykosyliert ist. DeepLoc53 geht davon aus, dass Bm10329 ein extrazelluläres Protein ist. In früheren Proteomics-Studien wurde es in membranangereicherten Proben identifiziert31 und in der räumlichen Transkriptomics-Studie wurde festgestellt, dass es im Darm angereichert ist72. Die eine kanonische Stelle ist sowohl bei weiblichen als auch bei männlichen Würmern bei 253 NVT N-glykosyliert. Diese Stelle kommt auch bei weiblichen Würmern aglykosyliert vor. Schließlich ist Bm10905 nicht nur auf die Unterordnung Spirurina, sondern auch auf die Familie Onchocercidae beschränkt. Es wird von DeepLoc53 vorhergesagt, dass es extrazellulär ist und ansonsten nicht charakterisiert ist. Unsere Daten zeigen, dass es von den möglichen 3 kanonischen N-Glykositen bei weiblichen Würmern an 2 Stellen bei 37 NTS und 93 NET und bei männlichen Würmern nur an Stelle 37 N-glykosyliert ist. Während der Mangel an Homologie zu charakterisierten Proteinen es schwierig macht, Bm14109, Bm10521, Bm10329 und Bm10905 irgendeine Funktion zuzuordnen, macht dieser unbestimmte Status zusammen mit ihren vorhergesagten und beobachteten zellulären Standortdaten diese N-Glykoproteine ​​zu attraktiven Kandidaten für weitere Untersuchungen.

Nematoden-beschränkte Beispiele für N-Glykoproteine ​​in Tabelle 2 sind Bm3266 und Bm8085. Die Genontologie geht davon aus, dass Bm3266 Lipide bindet, und DeepLoc53 geht davon aus, dass es sich um ein extrazelluläres Protein handelt. Die RNAi seines C. elegans-Orthologen F10D11.6 zeigte embryonale und larvenletale Phänotypen78. Obwohl Bm3266 über 5 kanonische N-Glykosite verfügt, ist es bei weiblichen Würmern sowohl bei 817 NTT als auch bei 884 NAS N-glykosyliert und bei männlichen Würmern nur bei 884. Es wird auch angenommen, dass Bm8085 ein extrazelluläres Protein ist und eine Domäne der Transthyretin-ähnlichen Familie (TTR) besitzt. Kürzlich wurden Proteine ​​mit dieser TTR-Domäne als Hauptantigene menschlicher Filarieninfektionen beschrieben24. Obwohl sein Ortholog in C. elegans wahrscheinlich aufgrund der Redundanz keinen RNAi-Phänotyp aufweist, hat es sich als wichtig für Zell-Zell-Interaktionen erwiesen. Speziell für C. elegans ttr-52 fungiert es als Brückenmolekül, das die Apoptose vermittelt79. Bm8085 ist sowohl in weiblichen als auch in männlichen Würmern an seinem einzigen kanonischen N-Glykosit 29 NGT N-glykosyliert. Da sie keine engen Orthologen im Wirtsgenom haben, könnten sowohl Bm3266 als auch Bm8085 interessante Kandidaten für weitere Untersuchungen sein.

Bm3610 kommt nur in männlichen und weiblichen Würmern vor, wobei fünf von acht kanonischen N-Glykositen bei weiblichen Würmern bei 131 NIS, 227 NMT, 272 NGS, 394 NRT und 477 NIS identifiziert wurden und 3 N-Glykosite bei männlichen Würmern bei 131, 227 identifiziert wurden und 477. Es handelt sich um ein Single-Pass-Transmembranprotein, von dem laut Genontologie vorhergesagt wird, dass es sich im Golgi befindet, während DeepLoc53 vorhersagt, dass es sich um ein ER-Protein/Enzym handelt. Die molekulare Funktion der Genontologie lässt vermuten, dass es Teil der Glycosyltransferase-Familie ist 14. Hierbei handelt es sich um eine gut konservierte, aber vielfältige Familie von Beta-1,6-N-Acetylglucosaminyltransferase-Enzymen, die lineare in verzweigte N-Acetyllactoseaminoglycane umwandeln oder entscheidende Seitenkettenverzweigungen bilden können O-Glykane. Frühere proteomische Studien stimmen nicht mit der vorhergesagten Position dieses Enzyms überein und haben Bm3610 im ES-Proteom29, Körperwandproteom42, Oberflächenproteom und Membranproteom31 gefunden. Die Orthologen von C. elegans, F30A10.4, R07B7.6 und F35H8.2, sind weitere Glykosyltransferasen, wobei letztere als Golgi-Membranprotein annotiert und an drei N-Glykosites N-glykosyliert ist21. Bemerkenswert ist, dass die N-Glykosite für diese und andere C. elegans-Orthologe, die durch BlastP39 identifiziert wurden, keine Überlappung mit Bm3610-N-Glykosylierungsstellen aufweisen und die Proteinidentität zwischen diesen Nematoden-Orthologen unter 40 % liegt. Bei der Suche nach menschlichen Orthologen mit BlastP39 finden wir Enzyme wie C2GnT380, ein O-Glykan-Verzweigungsenzym vom Mucin-Typ mit 30 % Proteinidentität. Und wie bei den Orthologen von C. elegans gibt es keine Überlappung mit den C2GnT3-N-Glykosylierungsstellen. Dies deutet darauf hin, dass Bm3610, obwohl es zur gleichen Familie der Glykosyltransferasen gehört, möglicherweise eine andere Rolle spielt oder auf einem anderen Substrat aktiv ist, insbesondere wenn dieses Enzym auf der Oberfläche vorhanden ist, wie aus den proteomischen Studien hervorgeht.

Nematoden sind eine vielfältige und große Gruppe von Organismen, die in fünf Gruppen unterteilt sind. Sowohl C. elegans als auch H. contortus gehören zu den Nematoden der Klasse V, während B. malayi und andere Filariennematoden zu einer eigenen Gruppe von Nematoden der Klasse III gehören34. Wir haben unsere Ergebnisse erweitert, indem wir die N-Glykoproteome von C. elegans und H. contortus verwendet haben, um nach gemeinsamen N-Glykoproteinen und N-Glykoproteinen, die nur in B. malayi vorkommen, zu suchen. Wir suchten zunächst nach Orthologen der identifizierten B. malayi-N-Glykoproteine ​​in diesen beiden Nematoden-Proteomen . Wir haben Orthologe für 425 von 582 B. malayi-N-Glykoproteinen identifiziert, so dass 157 Filarien- oder B. malayi-spezifische N-Glykoproteine ​​übrig blieben, für die in C. elegans oder H. contortus kein Ortholog identifiziert wurde (Ergänzungstabelle S6C. elegans- und H. contortus-Orthologe, Abb . 6). Da C. elegans und H. contortus beide Clade-V-Nematoden sind und eng miteinander verwandt sind, überrascht es nicht, dass 361 B. malayi-N-Glykoproteine ​​in beiden Arten Orthologe aufwiesen (Abb. 6: grau eingerahmt). Nur 31 N-Glykoprotein-Orthologe von B. malayi waren einzigartig für C. elegans (Abb. 6: 2. und 4. Balken) und 33 einzigartig für H. contortus (Abb. 6: 3. und 5. Balken). Anschließend überprüften wir, ob die Orthologen von C. elegans oder H. contortus in ihren jeweiligen N-Glykoproteomen vorhanden waren21,32,35. Während 31 N-Glykoproteine ​​von B. malayi sowohl C. elegans- als auch H. contortus-Orthologe aufweisen, die ebenfalls als N-Glykoproteine ​​identifiziert wurden, weisen 119 N-Glykoproteine ​​von B. malayi Orthologe von C. elegans auf, die ebenfalls N-Glykoproteine ​​sind, und 71 B. malayi N-Glykoproteine, die ebenfalls als N-Glykoproteine ​​identifiziert wurden. Malayische N-Glykoproteine ​​haben H. contortus-Orthologe, die ebenfalls N-Glykoproteine ​​sind. Dieser gemeinsame Satz von N-Glykoproteinen von B. malayi, C. elegans und H. contortus kann weiter untersucht werden, um wichtige Proteine ​​zu identifizieren, die für den Nematoden-Lebenszyklus einzigartig sind und einzigartig oder anders als der Säugetierwirt sind. Wir gehen davon aus, dass einige dieser orthologen N-Glykoproteine ​​N-Glykosites aufweisen, die ausgerichtet oder konserviert sind, und andere, die sich unterscheiden, wie bereits für das ES-62- und H11-Antigen gefunden. Wir haben dies weiter untersucht, indem wir ein mehrfaches Alignment55 eines gut konservierten N-Glykoproteins, Integrin Beta, verwendet haben, das in allen drei Nematoden-N-Glykoproteomen vorhanden ist (ergänzende Abbildung S2). Bm7611 Beta-Integrin hat sieben identifizierte N-Glykosite von möglichen acht kanonischen N-Glykosites bei 54 NYT, 276 NNS, 407 NAS, 537 NES, 679 NET, 700 NDT und 728 NLT, wobei drei Stellen in allen drei Proben glykosyliert sind, eine Stelle einzigartig für männliche Proben und 2 Standorte einzigartig für Mikrofilarienproben. Im Beta-Integrin-Ortholog von C. elegans (72 % Identität) wurden acht N-Glykosite identifiziert, darunter fünf ausgerichtete N-Glykosite bei 54, 276, 407, 537, 679 und 700 sowie ein anderes N-Glykosite bei 143 NVT, das kein kanonisches N-Glykosit in B. malayi ist, aber in der H. contortus-Sequenz geteilt wird. Eine zweite identifizierte Stelle ist bei 400 NAS einzigartig für C. elegans und kommt in den anderen beiden Orthologen nicht vor. Das H. contortus-Integrin-Beta-Ortholog (72 % Identität) hat zwei identifizierte N-Glykosite bei 407 und 537. Es hat keine kanonischen N-Glykosite, die mit 276 oder 679 übereinstimmen, aber es stimmt mit den übrigen identifizierten B. malayi-N-Glykosite überein Dies könnte darauf hindeuten, dass diese Stellen in anderen Stadien des Lebenszyklus des H. contortus-Nematoden N-glykosyliert sind. Somit verdeutlichen die an den ausgerichteten oder konservierten N-Glykositen beobachteten Unterschiede die Möglichkeit einer Variation der N-Glykosit-Belegung basierend auf der Gewebeexpression oder den Lebensstadien. Darüber hinaus sind die 157 N-Glykoproteine ​​ohne Orthologe ein vielversprechender Satz von Proteinen, die es zu erforschen gilt, da es sich möglicherweise um Filarien- oder B. malayi-spezifische N-Glykoproteine ​​handelt.

UpSetR-Datenanalyse von Orthologen zu B. malayi-N-Glykoproteinen in C. elegans und H. contortus: HCON_N-Glykoprotein gibt alle H. contortus-Orthologe an, die als N-Glykoproteine ​​identifiziert wurden. HCON_ortholog gibt verbleibende H. contortus-Orthologe an, die nicht als N-Glykoproteine ​​identifiziert wurden. CELE_N-Glykoprotein gibt alle C. elegans-Orthologen an, die als N-Glykoproteine ​​identifiziert wurden. CELE_ortholog gibt verbleibende C. elegans-Orthologe an, die nicht als N-Glykoproteine ​​identifiziert wurden. Kein Ortholog weist darauf hin, dass weder bei C. elegans noch bei H. contortus identifizierte Orthologe vorhanden waren. Die links angezeigte Satzgröße gibt die Anzahl der Proteine ​​in jedem Satz an. Die Balken über den einzelnen Punkten zeigen die Anzahl der N-glykosylierten Proteine, die für diesen Proteinsatz einzigartig sind. Die Balken über den mehreren verbundenen Punkten zeigen die Anzahl der N-glykosylierten Proteine, die mit diesem Proteinsatz gemeinsam sind. Der graue Kasten zeigt die N-Glykoproteine ​​von B. malayi, die in beiden Arten Orthologe hatten.

Zusammen mit anderen N-Glykoproteomen von Nematoden und einzelnen N-Glykoproteinen von B. malayi trägt diese Kartierung von 1273 N-Glykositen von B. malayi in 582 N-Glykoproteinen von erwachsenen männlichen Würmern, erwachsenen weiblichen Würmern und Mikrofilarien weiter zu den proteomischen Daten bei zu unserem aktuellen Verständnis der N-Glykosylierung dieses Filaritenparasiten. Die N-Glykosite-Kartierung aus der Fbs1-Anreicherung von N-Glykopeptiden ergab hochangereicherte Datensätze, indem sowohl die Anzahl als auch der Anteil der identifizierten N-Glykosites erhöht und gleichzeitig der Hintergrund von N + 3-Peptiden ohne kanonische N-Glykosite-Motive verringert wurde. Genontologie und Vorhersage der Zelllokalisierung zeigten, dass das N-Glykoproteom mit Membran- und extrazellulären Proteinen angereichert war. Wir haben gezeigt, dass dieser Satz von N-Glykoproteinen auf unterschiedliche Weise abgebaut werden kann. Die Charakterisierung der N-Glykositbelegung einzelner Proteine, wie sie für hochglykosylierte Proteine ​​in Tabelle 1 angegeben und für Bm7191 in Abb. 3 dargestellt ist, zeigte Variationen, die auf biologische Unterschiede hinweisen könnten und die weiter untersucht werden müssen, um ihre Bedeutung zu bestimmen. In ähnlicher Weise bestätigte die Untersuchung der N-Glykosylierung zuvor identifizierter Kutikula- und immunmodulierender Proteine ​​in diesen drei Wirtsstadien die Variation in der N-Glykositbelegung, die in diesen biologisch wichtigen Proteinen vorhanden ist. Die Untersuchung von Proteingruppen wie dem eingeschränkten Satz erwachsener Würmer und ihrer Beziehung zur Parasitenbiologie führte zur Identifizierung von Parasiten- und Nematoden-spezifischen N-Glykoproteinen an der Wirtsschnittstelle. Jene N-Glykoproteine, die ohne Wirtsorthologe identifiziert wurden, sind vielversprechende therapeutische oder Biomarker-Kandidaten. Als Folgemaßnahme zu dieser Arbeit planen wir, die mit Fbs1 angereicherten Peptide ohne PNGase-F-Spaltung zu charakterisieren, um die intakten N-Glykopeptide zu untersuchen und Glykanstrukturen mit spezifischen Glykositen zu korrelieren81. Neben der Bestätigung unserer N-Glykosit-Kartierung und -Belegungsstudie wird die Charakterisierung der N-Glykanstrukturen und ihrer Heterogenität an jedem Standort für männliche Würmer, weibliche Würmer und Mikrofilarien ein umfassendes Verständnis der N-Glykosylierung von Filarienparasitenproteinen liefern.

Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE38-Partnerrepository mit der Datensatzkennung PXD039002 und 10.6019/PXD039002 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt.

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Wir danken Clotilde S. Carlow, Thomas C. Evans Jr., Lindsey J. Cantin, Laudine MC Petralia und Douglas M. Oswald für kritisches Feedback und Korrekturlesen des Manuskripts. Wir danken Herrn James Ellard und Dr. Salvatore V. Russello für die kontinuierliche Unterstützung der Parasiten-Glykobiologie-Forschung.

FM, CM, CR, MC und JF erhielten Fördermittel und waren zum Zeitpunkt der Durchführung der Arbeiten bei New England Biolabs beschäftigt. CR ist jetzt Mitarbeiter von Moderna. Diese Zugehörigkeiten ändern nichts an unserer Einhaltung aller Richtlinien von Scientific Reports zur Weitergabe von Daten und Materialien.

New England Biolabs, Ipswich, MA, 01938, USA

Fana B. Mersha, Colleen M. McClung, Minyong Chen, Cristian I. Ruse und Jeremy M. Foster

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JF konzipierte die Experimente und überwachte das Projekt, FM entwarf und führte die Experimente durch, mit Unterstützung von MC zur Fbs1-Anreicherung und CM und CR zur Massenspektrometrie. FM analysierte die Ergebnisse, erstellte Grafiken und verfasste das Manuskript. Alle Autoren trugen zur Überarbeitung, Bearbeitung und Genehmigung des endgültigen Manuskripts bei.

Korrespondenz mit Fana B. Mersha oder Jeremy M. Foster.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mersha, FB, McClung, CM, Chen, M. et al. Definition des Filarien-N-Glykoproteoms durch Glykosite-Kartierung im menschlichen parasitären Nematoden Brugia malayi. Sci Rep 13, 7951 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34936-9

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Eingegangen: 08. Februar 2023

Angenommen: 10. Mai 2023

Veröffentlicht: 16. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34936-9

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