Prostaglandin

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1169 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Prostaglandin-Analoga sind die Erstbehandlung bei Offenwinkelglaukom. Sie senken zwar wirksam den Augeninnendruck, werden jedoch durch mangelnde Compliance des Patienten beeinträchtigt, was zu einer Atrophie des Sehnervs und einer schweren Sehbeeinträchtigung führt. Hierin bewerten wir die Sicherheit und Wirksamkeit einer durch rekombinante Adeno-assoziierte virale Vektoren vermittelten Gentherapie, die auf eine dauerhafte Senkung des Augeninnendrucks durch De-novo-Biosynthese von Prostaglandin F2α in der Vorderkammer abzielt. Diese Studie zeigte eine dosisabhängige Senkung des Augeninnendrucks bei normotensiven Brown-Norway-Ratten, die über einen Zeitraum von 12 Monaten aufrechterhalten wurde. Entscheidend ist, dass die Therapie durch die Aktivierung eines Off-Type-Riboschalters vorübergehend unterbrochen werden könnte, wodurch der Augeninnendruck wieder auf den Normalwert zurückgeführt wird. Longitudinale multimodale Bildgebung, Elektrophysiologie und Post-Mortem-Histologie zeigten, dass die Therapie bei niedrigen und mittleren Dosen gut vertragen wurde und keine größeren negativen Auswirkungen auf die Gesundheit der Vorderkammer hatte. Sie stellt eine vielversprechende Alternative zu aktuellen Behandlungsstrategien dar, die zu klinisch relevanten Senkungen des Augeninnendrucks führt die Notwendigkeit der Einhaltung eines täglichen Behandlungsplans.

Das Offenwinkelglaukom (OAG) ist eine komplexe Augenerkrankung, von der weltweit etwa 79,6 Millionen Menschen betroffen sind und die zum fortschreitenden Verlust retinaler Ganglienzellen, axonaler Schädigung im Sehnerv und schließlich zur Erblindung führt1. Während das Offenwinkelglaukom mehrere umweltbedingte und genetische Risikofaktoren aufweist, konzentriert sich die Physiopathologie, die der Erhöhung des Augeninnendrucks zugrunde liegt, auf das Ungleichgewicht zwischen der Produktion von Kammerwasser durch den Ziliarkörper und dem Abfluss von Kammerwasser durch das Trabekelnetzwerk2. Daher konzentrieren sich aktuelle Behandlungsstrategien – sowohl pharmakologische als auch chirurgische – darauf, eine Senkung des Augeninnendrucks zu erreichen, entweder durch Hemmung der Kammerwasserproduktion oder durch Erhöhung der Kammerwasserableitung, mit dem Ziel, den mechanischen Druck auf die Netzhaut und den Sehnerv zu verringern, um das Sehvermögen zu erhalten3, 4,5.

Pharmakologische Wirkstoffe werden als Erstbehandlung verabreicht und lassen sich in fünf Hauptklassen einteilen: Carboanhydrasehemmer, adrenerge Agonisten, RHO-Kinasehemmer, Betablocker und Prostaglandin-F2α-Analoga (PGF2α), wobei letztere am häufigsten eingesetzt werden6,7,8. PGF2α-Analoga wie Latanoprost, Bimatoprost und Travoprost werden über Augentropfen topisch als Prodrugs auf die Hornhautoberfläche aufgetragen, wo sie über das Hornhautepithel absorbiert und beim Durchqueren des Stromas in aktive Konformationen hydrolysiert werden, bevor sie in das Stroma freigesetzt werden der wässrige Humor. Nach der Freisetzung in den Kammerwasser führen PGF2α-Analoga zu einer verstärkten Drainage über den uveoskleralen Ausflussweg, nachdem die extrazelluläre Matrix, die den Ziliarmuskel umgibt, umgestaltet wird6,9,10,11,12,13. Während die Verwendung topischer Mittel wirksam sein und zu einer Senkung des Augeninnendrucks um etwa 25 % führen kann, ist ihre Verwendung mit zahlreichen Nebenwirkungen verbunden, darunter Reizungen der Augenoberfläche, verschwommenes Sehen, Verfärbung der Iris (Hyperpigmentierung), Rötung (Hyperämie) und übermäßiges Wachstum oder Verdickung der Wimpern (Hypertrichose), Vertiefung der Augenlider (Orbitopathie), Überempfindlichkeit gegen Licht und Wiederauftreten gleichzeitiger Infektionen (z. B. herpetische Keratitis)14,15,16,17,18. Aufgrund der schlechten Verträglichkeit aktueller pharmakologischer Behandlungen für OAG, verbunden mit Schwierigkeiten bei der korrekten Anwendung von Augentropfen und dem Fehlen einer unmittelbaren negativen Rückmeldung bei versäumten Dosen, haben Patienten häufig Probleme mit der Einhaltung der täglichen Behandlungspläne. Tatsächlich zeigten Studien, in denen die Verwendung von Augentropfen durch Patienten elektronisch überwacht wurde, eine äußerst schlechte Einhaltung bestehender pharmakologischer Behandlungen, wobei 44 % der Patienten ihre Augentropfen in weniger als 75 % der Fälle verwendeten19,20.

Infolgedessen gab es in den letzten Jahren ein Bestreben, länger wirksame pharmakologische Behandlungen zu entwickeln, wobei der Schwerpunkt auf Arzneimittelimplantaten mit verzögerter Freisetzung lag, die sowohl in klinischen Studien an großen Tieren als auch an Menschen untersucht wurden21,22,23,24,25,26. Es wurde nachgewiesen, dass Implantate wie Bimatoprost mit verzögerter Freisetzung eine Senkung des Augeninnendrucks für bis zu 24 Monate bewirken; allerdings hielten nur 28 % der Teilnehmer über diesen Zeitraum einen kontrollierten Augeninnendruck aufrecht und weitere 26,5 % der Patienten benötigten Notfall-Augentropfen oder eine erneute Verabreichung von Implantaten nach einer Degradation23. Neben der nachhaltigen Senkung des Augeninnendrucks bei der Mehrzahl der Patienten besteht ein weiterer bemerkenswerter Vorteil solcher Implantate darin, dass die Häufigkeit bestimmter Nebenwirkungen im Vergleich zu Patienten, die topische Augentropfen erhielten, verringert wurde, obwohl Patienten, die Bimatoprost mit verzögerter Freisetzung erhielten, eine Bindehauthyperämie aufwiesen , Makulaödem und intraokulare Entzündung27. Während sich Implantate als relativ sicher erwiesen haben, gibt es Patienten, die infolge des Implantatersatzes einen Verlust von Hornhautendothelzellen entwickeln. Aus diesem Grund hat die Federal Drug Administration (FDA) die Anzahl der Patienten bisher auf ein 10-µg-Implantat pro Auge beschränkt, ohne dass dies erforderlich ist. Verwaltung erlaubt27.

Obwohl die genetische Ätiologie, die der Entwicklung von OAG zugrunde liegt, bei der Mehrzahl der Patienten unvollständig geklärt ist, bleibt die Gentherapie eine attraktive Therapiestrategie, die eine lebenslange Korrektur des Krankheitsphänotyps nach einem einzigen Eingriff ermöglichen kann28,29,30. Aufgrund der einzigartigen Eigenschaften des Auges standen ophthalmologische Indikationen in den letzten Jahrzehnten im Vordergrund der Gentherapie und konzentrierten sich typischerweise auf die Verwendung rekombinanter Adeno-assoziierter Virus-Vektoren (rAAV), die in zahlreichen Fällen nachgewiesen wurden präklinische und klinische Studien zur Vermittlung einer sicheren und dauerhaften Transgenexpression in einer Vielzahl von Augenzelltypen und über eine Reihe von Arten hinweg31,32,33,34,35. Während sich die Mehrzahl der Studien auf die Behandlung seltener vererbter monogener Netzhauterkrankungen wie der Leberschen kongenitalen Amaurose, Choroiderämie und Achromatopsie konzentrierte, kann die Gentherapie auch zur Behandlung von Krankheiten mit komplexer Ätiologie wie OAG eingesetzt werden, sofern die zugrunde liegende Physiopathologie berücksichtigt wird ist gut verstanden36,37,38,39,40,41,42. Da jahrzehntelange klinische Praxis einen klaren Zusammenhang zwischen einer Senkung des Augeninnendrucks und positiven Sehergebnissen bei Patienten mit OAG gezeigt hat, schlagen wir vor, dass okuläre Hypertonie einen klaren und modifizierbaren Risikofaktor darstellt, der über einen gentherapeutischen Ansatz moduliert werden könnte, um das Sehvermögen bei OAG zu erhalten Patienten. Da Prostaglandin-Analoga ein Goldstandard für die OAG-Behandlung sind und den Augeninnendruck hochwirksam senken, wenn sie nicht durch mangelnde Patientencompliance untergraben werden, wollten wir insbesondere eine gentherapeutische Behandlung entwickeln, um die Biosynthese von PGF2α direkt im Auge durch rAAV-vermittelte Überempfindlichkeit zu fördern. Expression von Prostaglandin-Endoperoxid-Synthase 2 (COX2) – dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym bei der Biosynthese von PGF2α – aus den Zellen der Vorderkammer43. Wir gehen davon aus, dass die Entwicklung einer rAAV-vermittelten Gentherapie zur Synthese und Freisetzung von nativem PGF2α ausreichen könnte, um den Augeninnendruck auf sichere und nachhaltige Weise zu senken, was zu verbesserten Sehergebnissen durch die Eliminierung von Patientenverstößen führt und gleichzeitig die Inzidenz und den Schweregrad verringert der Nebenwirkungen, die bei der topischen Verabreichung von Prostaglandin-Analoga beobachtet werden.

Hier verwenden wir normotensive Brown-Norway-Ratten (BN), um die Sicherheit und Wirksamkeit unserer PGF2α-exprimierenden rAAV-Gentherapie zu bewerten, die darauf abzielt, den Augeninnendruck bei Patienten mit Augenhypertonie nach einer einzelnen therapeutischen Dosis zu senken. Mithilfe einer Kombination aus multimodaler Bildgebung, Elektrophysiologie, Tonometrie und Post-Mortem-Histologie zeigen wir einen klaren dosisabhängigen Zusammenhang zwischen verabreichten Vektorgenomen und dem Augeninnendruck. Bezeichnenderweise erreichten wir bei einer gut verträglichen Dosis über einen Zeitraum von 12 Monaten eine klinisch relevante Verringerung der Augenhypertonie. Einzigartig ist, dass wir durch die Aufnahme von auf Tetracyclin reagierenden Riboschalterelementen in die Expressionskassette zeigen, dass die Transgenexpression durch die Verabreichung eines oralen Arzneimittels vorübergehend, aber effektiv „ausgeschaltet“ werden kann, was zu einer Umkehr in Richtung Normotonie führt. Diese Therapie würde einen Paradigmenwechsel in der klinischen Behandlung von OAG darstellen und durch die Beseitigung von Compliance-Problemen des Patienten bessere Sehergebnisse ermöglichen und die Lebensqualität des Patienten durch geringere medizinische Belastung, Kosten und geringere Nebenwirkungen erhöhen.

Um die De-novo-Produktion von PGF2α aus Zellen der Vorderkammer zu erleichtern, haben wir zunächst eine Expressionskassette geklont, die für codonoptimiertes menschliches COX2 – das geschwindigkeitsbestimmende Enzym in der PGF2α-Biosynthese – zusätzlich zum durch a getrennten menschlichen Prostaglandin-F-Rezeptor (PTGFR) kodiert P2A-Spaltungsstelle und angetrieben durch einen allgegenwärtig exprimierenden Small Chicken Beta Actin (CBA)-Promotor. Der Einschluss von PTGFR in das Expressionskonstrukt wurde gewählt, um einen „biologischen Kreislauf“ aufzubauen, in dem sowohl das Effektormolekül (PGF2α) als auch sein eigener Rezeptor in großen Mengen im Zielgewebe vorhanden sind, eine Strategie, die bereits zuvor bei Katzen gezeigt wurde führen zu einer stärkeren Senkung des Augeninnendrucks als die Expression von COX2 allein44.

Die Expressionskassette wird von invertierten terminalen Wiederholungen (ITRs) flankiert, die von AAV2 abgeleitet sind, um die Verpackung in einen rekombinanten rAAV-Vektor zu ermöglichen, und enthält außerdem zwei „Off-Type“-Tetracyclin-responsive Riboswitch-Elemente (TC40 und TC45), von denen wir zuvor gezeigt haben, dass sie dies ermöglichen zur posttranskriptionellen Herunterregulierung der Transgenexpression eines rAAV-Vektors, der nach oraler Gabe des aktivierenden Liganden (z. B. Tetracyclin) in das Auge injiziert wird45,46. Obwohl die Riboschalter TC40 und TC45 nicht in Zellen der Vorderkammer exprimiert wurden, ist bekannt, dass sich Tetracyclin nach oraler Gabe in der Hornhaut und im Kammerwasser ansammelt und daher voraussichtlich für die Riboschalter-Elemente bioverfügbar ist, um die Genmodulation voranzutreiben47. Die Einbeziehung eines Ausschalters in die Expressionskassette ist ein entscheidender Gesichtspunkt für die Entwicklung einer gentherapeutischen Behandlung zur Senkung des Augeninnendrucks auf Prostaglandinbasis, bei der die klinische Behandlung von OAG eine vorübergehende Beendigung der PGF2α-Behandlung erforderlich machen kann, falls bei einem Patienten gleichzeitig eine Erkrankung auftritt Infektionen wie Herpeskeratitis18,48,49.

Die biologische Aktivität des resultierenden CBA.COX2.P2A.PTGFR.TC40/TC45-Konstrukts (hier als CCPP bezeichnet) (Abb. 1a) wurde zunächst in vitro durch Transfektion von HEK293T-Zellen validiert, was zu einem signifikant erhöhten (ungepaarten T-Test, p = 0,0056, N = 2 (scheintransfiziert), N = 3 (CCPP-transfiziert)) PGF2α-Spiegel, die im Vergleich zu scheintransfizierten Kontrollen in das Kulturmedium sezerniert werden (Abb. 1b). Nachdem festgestellt wurde, dass die CCPP-Expressionskassette eine signifikant erhöhte Produktion von PGF2α katalysiert, wurde das Konstrukt anschließend in rAAV2/2[MAX] verpackt, einen von rAAV2 abgeleiteten Kapsidmutantenvektor, der mehrere Einzelpunktmutationen enthält (Quad YF + TV: Y272F, Y444F, Y500F). , Y730F und T491V) und eine Peptidinsertion (7m8: R588_Q589insLALGETTRPA), von der bekannt ist, dass sie die Transduktionseffizienz und Gewebepenetration in mehreren Augenzelltypen erhöht50,51,52. Bei Injektion in die Vorderkammer von BN-Ratten transduziert dieser Kapsidmutanten-Serotyp-Vektor Zellen des peripheren Hornhautendothels, der Iris und des Iridokornealwinkels (Abb. 1c, d).

Eine schematische Darstellung des CCPP-Transgens, das von einem CMV-Enhancer und einem smCBA-Promotor angetrieben wird und zwei Riboschalter vom Tetracyclin-Off-Typ (TC40 und TC45) sowie durch ein P2A-Spaltungssignal getrenntes menschliches Codon-optimiertes COX2 und PTGFR enthält (a). Ein PGF2ɑ-ELISA bestätigte signifikant höhere Konzentrationen von PGF2ɑ in Zellkulturmedien nach Transfektion mit CCPP-Transgen als Medien, die aus scheintransfizierten Zellen (b) gesammelt wurden (ungepaarter T-Test, p = 0,0056, N = 2 (scheintransfiziert), N = 3 (CCPP). transfiziert), Fehlerbalken = SD). Hellfeld- und Fluoreszenzbildgebung von rAAV2/2[MAX]-smCBA-mCherry-Augen 8 Wochen nach der Injektion bestätigen den Vektortropismus in der Iris, dem Hornhautendothel und dem Ziliarkörper (c, d). Maßstabsleiste = 150 µm, Vergrößerung = 20×.

Jugendliche (Postnatalwoche 6–8) BN-Ratten (N = 30: 15 männlich und 15 weiblich), die von einem kommerziellen Züchter importiert wurden, wurden umfassenden augenärztlichen Untersuchungen unterzogen, um das Vorhandensein von Entwicklungs- oder anderen Anomalien in der Netzhaut- oder Hornhautstruktur oder -funktion auszuschließen. Wichtig ist, dass alle Tiere einen stabilen Augeninnendruck (IOD; 19,52 ± 3,23 mmHg, 1 SD, N = 30 Augen) aufwiesen, bevor sie intraokulare rAAV2/2[MAX].CCPP-Injektionen erhielten. BN-Ratten wurden zufällig einer von drei experimentellen Kohorten zugeordnet und erhielten eine einseitige intrakamerale Injektion mit gleichem Volumen (10 μl), die entweder einen niedrigen (3,9 × 109 vg/Auge), einen mittleren (3,9 × 1010 vg/Auge) oder hohen (3,9 × 1010 vg/Auge) Wert enthielt × 1011 vg/Auge) Dosis des gereinigten rAAV2/2[MAX].CCPP-Vektors. Das kontralaterale Auge blieb bei allen Tieren ohne Injektion, um als intra-tierische Kontrolle zu dienen und jeglichen Vektorrückfluss zu begrenzen, der während der Neupositionierung des Tieres auftreten könnte.

1, 2, 6, 9 und 12 Monate nach der Injektion wurde die Rebound-Tonometrie an wachen BN-Ratten von Untersuchern wiederholt, die in Bezug auf die Behandlungsgruppe maskiert waren, um Veränderungen des Augeninnendrucks als Reaktion auf die Therapie zu ermöglichen objektiv gemessen. Ratten mit niedrig dosiertem BN zeigten zu allen Zeitpunkten im Zeitverlauf im Vergleich zu den Ausgangsmessungen eine nicht signifikante (NS) Verringerung des Augeninnendrucks (Abb. 2a; Mehrfachvergleichstest nach Dunnett, p ≥ 0,05 bei allen Vergleichen, N = 11) und es gab keinen signifikanten Trend beobachtet über den gesamten 12-monatigen Auswertungszeitraum (Abb. 2b; einfache lineare Regression, p = 0,1549).

Zwischen den Gruppen wurde eine dosisabhängige Verringerung des Augeninnendrucks festgestellt: Tiere mit niedriger, mittlerer und hoher Dosis zeigten eine Verringerung um 12,6 %, 21,87 % bzw. 43,2 % nach 12 Monaten (a, c und e), die über 12 Monate aufrechterhalten wurde (b; einfache lineare Regression, p = 0,1549, N = 11 d; p = 0,0036, N = 9 und f; p < 0,0001, N = 10, Fehlerbalken = SD). Nach 12 Monaten wurde den Tieren eine 5-prozentige Tetracyclin-Diät verabreicht, und der Augeninnendruck stieg bei Tieren mit mittlerer bzw. hoher Dosis nach einem Monat um 21,5 % bzw. 22,5 % (c und e).

Ratten mit mittlerer Dosis zeigten nach 6 Monaten eine signifikante Verringerung des Augeninnendrucks (Abb. 2c; Dunnetts Mehrfachvergleichstest, p = 0,01, N = 9), und über den Zeitraum von 12 Monaten wurde ein signifikanter Trend zur Abnahme des Augeninnendrucks festgestellt (Abb. 2d). ; einfache lineare Regression, p = 0,0036) mit einer Verringerung des Augeninnendrucks um 21,88 % vom Ausgangswert bis 12 Monate.

Ratten, die mit hoher Dosis behandelt wurden, zeigten nach 6, 9 und 12 Monaten eine signifikante Senkung des Augeninnendrucks gegenüber dem Ausgangswert (Abb. 2e; Mehrfachvergleichstest nach Dunnett, p ≤ 0,0021, N = 10) mit einem hochsignifikanten Trend zur Senkung des Augeninnendrucks über den 12-Monats-Zeitraum (Abb. 2f, einfache lineare Regression, p < 0,0001). Mit einer hohen Dosis behandelte Ratten zeigten nach 12 Monaten die stärkste Senkung des Augeninnendrucks gegenüber dem Ausgangswert, mit einer Gesamtsenkung von 43,22 %. Wichtig ist, dass in keiner Dosierungsgruppe zu irgendeinem Zeitpunkt während der gesamten Studie Anzeichen einer Hypotonie (IOD ≤ 5 mmHg) auftraten.

12 Monate nach der Injektion wurden eine männliche und eine weibliche Ratte aus jeder Dosierungsgruppe für die Histologie getötet und die übrigen Tiere auf eine spezielle Diät mit 5 Gew.-% Tetracyclin gesetzt, um die Genexpression durch Aktivierung von TC40 „auszuschalten“. und TC45-Riboschalterelemente, die in das Vektorgenom eingebaut sind. Nach einem Monat der Nahrungsergänzung mit Tetracyclin wurde die Tonometrie wiederholt, um festzustellen, ob die Unterdrückung der Transgenexpression zu einer Umkehr des Augeninnendrucks in Richtung Normaldruck führte. BN-Ratten, denen eine niedrige Dosis des Vektors rAAV2/2[MAX].CCPP injiziert wurde, zeigten im Vergleich zu den Tonometriebewertungen nach der Injektion oder dem Ausgangswert vor der Injektion keine signifikanten Veränderungen des Augeninnendrucks, was darauf hindeutet, dass die Verabreichung von Tetracyclin keinen direkten Einfluss auf den Augeninnendruck hatte ( Abb. 2a, Dunnetts Mehrfachvergleichstest, p = 0,4461, N = 9). Wichtig ist, dass der Augeninnendruck von BN-Ratten, denen eine mittlere Dosis des Vektors rAAV2/2[MAX].CCPP injiziert wurde, eine fast vollständige Rückkehr zur Normalspannung zeigte, wobei der Augeninnendruck im Vergleich zu 12-Monats-Messungen um 21,5 % anstieg (Abb. 2c, N = 6). . Tiere mit hoher Dosis zeigten eine signifikante Rückkehr zum Ausgangs-IOD (Abb. 2e; Dunnetts Mehrfachvergleichstest, p = 0,0283, N = 7), wobei der mittlere IOD im Vergleich zu 12 Monaten um 22,5 % anstieg.

Um zu beurteilen, ob die De-novo-Biosynthese von PGF2α in der Vorderkammer Auswirkungen auf die Gesundheit der Netzhaut hat, führten wir zu Studienbeginn und nach 12 Monaten eine konfokale Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (cSLO) und eine optische Kohärenztomographie (OCT) durch, um Veränderungen im Reflexionsvermögen und der Dicke der Netzhaut festzustellen. jeweils. Die cSLO-Bildgebung zeigte nach 12 Monaten ein erhöhtes Nahinfrarot-Reflexionsvermögen (NIR) und ein „gestreiftes“ Erscheinungsbild des Augenhintergrunds sowohl bei unbehandelten Augen (Kontrolle) als auch bei Augen mit rAAV2/2[MAX].CCPP-Vektorinjektion im Vergleich zum Ausgangswert in den niedrigen Augen (ergänzende Abb. 1a – d), mittlere (ergänzende Abbildung 1e – h) und hohe (ergänzende Abbildung 1i – l) Dosisgruppen, was darauf hindeutet, dass alle beobachteten Veränderungen der Netzhautmorphologie unabhängig von der Behandlung oder Dosis auftraten und stattdessen wahrscheinlich mit normalem Altern zusammenhängen.

Fünf gemittelte OCT-B-Scans durch den Sehnervenkopf bei allen Tieren zu Studienbeginn und 12 Monate nach der rAAV2/2[MAX].CCPP-Injektion wurden in der OCT-Reflexionsanalyse (ORA) analysiert, um die Netzhautdicke zu quantifizieren (ergänzende Abbildung 2)53 . 10 Längsreflexionsprofile (LRPs) wurden in 250-Mikrometer-Schritten vom Sehnerv aus erstellt und zur Bestimmung der Netzhautdicke verwendet, gemessen von der Nervenfaserschicht der Netzhaut bis zum RPE (Abb. 3). Eine signifikante Verringerung der Netzhautdicke wurde nach 12 Monaten sowohl bei unbehandelten (Abb. 3a–c) als auch bei mit rAAV2/2[MAX].CCPP-Vektor injizierten (Abb. 3d–f) Augen im Vergleich zum Ausgangswert beobachtet; Mindestens eine Exzentrizität in der Gruppe mit hoher und niedriger Dosis zeigte Signifikanz (zweifache ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest, p = 0,0123–0,0335 (*), 0,0027–0,0087 (**), 0,0007 (***) und < 0,0001(****), N = 8/Gruppe), wohingegen Augen, die mit rAAV mit mittlerer Dosis behandelt wurden (Abb. 3e), einen gewissen Grad an Ausdünnung zeigten, aber keine Signifikanz erreichten (Zwei-Wege-ANOVA, Sidaks Mehrfachvergleichstest, p > 0,1072, N = 6). Da bei mehreren Arten eine Netzhautverdünnung als Funktion des Alters nachgewiesen wurde und bei behandelten und unbehandelten Augen in allen Dosisgruppen beobachtet wurde, nehmen wir an, dass die beobachtete verringerte Netzhautdicke auch das Ergebnis normaler Alterung ist54,55,56,57,58 ,59,60.

Im Vergleich zu den Ausgangsmessungen wurde nach 12 Monaten sowohl bei unbehandelten (a–c) als auch bei behandelten Augen (d, f) eine signifikante Ausdünnung der Netzhaut bei verschiedenen Exzentrizitäten vom Sehnerv beobachtet. Bei den mit mittlerer Dosis behandelten Augen wurde keine signifikante Ausdünnung festgestellt (e). (Zweifaktorielle ANOVA mit Post-hoc-Mehrfachvergleichstest von Sidak, p = 0,0123–0,0335 (*), 0,0027–0,0087 (**), 0,0007 (***) und <0,0001(****)). Boxplot-Elemente: Mittelwert = +, Mittellinie = Median, Boxgrenzen = 25. und 75. Perzentil, Whiskers = Min. und Max.

Um zu untersuchen, ob die CCPP-Transgenexpression einen negativen Einfluss auf die Netzhautfunktion hat, wurden Vollfeld-Elektroretinogramm-Aufzeichnungen (ffERG) für behandelte und unbehandelte Augen dunkeladaptierter Ratten gesammelt (Abb. 4). Es wurden keine signifikanten Unterschiede in den A-Wellen- oder B-Wellen-Amplituden zwischen behandelten und unbehandelten Augen in den Gruppen mit niedriger Dosis (N = 11), mittlerer Dosis (N = 8) oder hoher Dosis (N = 10) bei jeder Intensität festgestellt (Abb . 4a–f; mehrere ungepaarte T-Tests p > 0,05 alle Gruppen, ergänzende Abb. 3). Trotz altersbedingter Veränderungen im Erscheinungsbild und in der Dicke der Netzhaut blieb die funktionelle Integrität der Netzhaut sowohl in behandelten als auch in kontralateralen unbehandelten Augen über einen Zeitraum von 12 Monaten mit allgegenwärtiger CCPP-Transgenexpression erhalten.

Die Quantifizierung der durchschnittlichen A- und B-Wellen-Amplituden jeder Dosierungsgruppe ist dargestellt (a–f). Es wurden keine signifikanten Veränderungen zwischen behandelten und unbehandelten Amplituden für A- oder B-Wellen gefunden (Mehrfach-T-Tests, p > 0,05 alle Gruppen. N = 11, 8 und 10 für niedrige, mittlere bzw. hohe Dosis. Boxplot-Elemente: Mittelwert = +, Mittellinie = Median, Boxgrenzen = 25. und 75. Perzentil, Whiskers = Min. und Max.

Nach intrakameraler Verabreichung des Vektors rAAV2/2[MAX].CCPP bei BN-Ratten wollten wir die Auswirkungen der De-novo-PGF2α-Biosynthese auf die Gesundheit der Vorderkammer mithilfe von OCT untersuchen, um die Dicke der zentralen Hornhaut und die Tiefe der Vorderkammer zu bestimmen. Die nach 12 Monaten durchgeführte OCT-Bildgebung der Hornhaut in rAAV2/2[MAX].CCPP-Vektor-injizierten (behandelten) und Kontrollaugen (unbehandelt) zeigte keine signifikanten Unterschiede in der zentralen Hornhautdicke bei beiden niedrigen (p = 0,7541, N = 9). ), mittlerer (p = 0,7475, N = 6) oder hoher (p = 0,2931, N = 6) Dosis behandeltes Auge (Abb. 5a–c; alle Vergleiche ungepaarte T-Tests). Im Gegensatz dazu zeigte die OCT-Bildgebung der Vorderkammer einen hochsignifikanten, dosisabhängigen Anstieg der Kammertiefe in niedrigen (Abb. 5d, g; +5,2 % p = 0,0125), mittleren (Abb. 5e, h; +8,1 %, p = 0,0447) und hoch dosierte (Abb. 5f, i; +24,3 %, p = <0,0001) Augen im Vergleich zu kontralateralen unbehandelten Kontrollaugen (alle Vergleiche ungepaarte T-Tests).

Die Dicke der zentralen Hornhaut war in keiner Dosierungsgruppe (a–c) zwischen unbehandelten und behandelten Augen signifikant verändert. Es wurde festgestellt, dass die Vorderkammertiefe bei mit niedriger (d, g), mittlerer (e, h) und hoher (f, i) Dosis behandelten Augen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen signifikant erhöht war. (Ungepaarter T-Test: p = 0,7541 (a), p = 0,0447 (b), p = 0,2931 (c), p = 0,0125 (d), p = 0,0447 (e) und p < 0,001 (f). N = 9, 6 und 6, für niedrige, mittlere bzw. hohe Dosis. Fehlerbalken = SD).

Um festzustellen, ob die CCPP-Transgenexpression oder die De-novo-Biosynthese von PGF2α Entzündungsreaktionen in der Vorderkammer hervorruft, wurden BN-Ratten 12 Monate nach der Behandlung Spaltlampenuntersuchungen unterzogen, um nach Hinweisen auf Zell-, Flare- oder Pigmentdispersion zu suchen, wobei die Bewertung mit 5 durchgeführt wurde Die Prüfer maskierten hinsichtlich der Tieridentität und der Behandlung, wobei sie je nach Bedarf ein modifiziertes Hackett-McDonald- und SUN-Bewertungsschema für Uveitis verwendeten61,62,63,64,65 (Ergänzungstabelle 1). Ein kleiner, aber signifikanter Anstieg der Vorderkammerzellzahl wurde bei Augen mit niedriger Dosis rAAV2/2[MAX].CCPP-Vektorinjektion im Vergleich zu Kontrollen beobachtet (Abb. 6ap = 0,0165, N = 9), aber dieser Trend setzte sich bei beiden nicht fort die Behandlungsgruppen mit mittlerer oder hoher Dosis (Abb. 6b, c, p = 0,7516 und 0,1099, N = 7 bzw. 5). In ähnlicher Weise zeigte keine Dosierungsgruppe einen signifikanten Zusammenhang zwischen der rAAV2/2[MAX].CCPP-Vektorbehandlung und dem Vorhandensein von Flare (Abb. 6d–f; p = 0,0952, p = 0,3938 bzw. p = 0,3451). Umgekehrt wurde beobachtet, dass die Pigmentdispersion bei niedriger (Abb. 6g, p = 0,0011), mittlerer (Abb. 6h, p = 0,0020) und hoher Dosis (Abb. 6i, p < 0,0001; alle Vergleiche exakter Fisher-Test) signifikant erhöht war ) rAAV2/2[MAX].CCPP-Vektor-injizierte Augen. Darüber hinaus entwickelten eine männliche und eine weibliche Ratte aus der Gruppe mit der höchsten Dosis im Alter von 12 Monaten ein Hyphäma, das eingeschläfert werden musste.

Von fünf maskierten Teilnehmern bewertete Spaltlampen-Untersuchungsfotos wurden zwischen unbehandelten und behandelten Augen für jede Dosierungsgruppe hinsichtlich Zell- (a–c), Flare- (d–f) und Irispigmentdispersion (g–i) verglichen. Ein genauer Fisher-Test ergab, dass im Fall von Zellen mit niedriger Dosis (a) die Zellpräsenz von der Vektorverabreichung abhängt, nicht jedoch für Gruppen mit mittlerer oder hoher Dosierung (b, c). In allen Fällen von Flare zeigte der exakte Fisher-Test, dass der Flare-Score unabhängig von der Vektorverabreichung ist (d–f). In ähnlicher Weise zeigten alle Dosierungsgruppen eine erhöhte Irisablösung, die von der Vektorverabreichung abhängig war (g–i). (Exakter Test nach Fisher: p-Werte = 0,0165 (a), 0,7516 (b), 0,1099 (c), 0,0952 (d), 0,3938 (e), 0,2451 (f), 0,0011 (g), 0,002 (h) und <0,001 (i). N = 9, 7 und 5 für niedrige, mittlere bzw. hohe Dosis).

Die nach 12 Monaten postmortal durchgeführte Elektronenmikroskopie weist darauf hin, dass sich die Morphologie der Iris zwischen nicht injizierten und injizierten Augen verändert hat, wobei die Iris eine fortschreitende Ausdünnung als Funktion der zunehmenden Vektordosis aufwies (Abb. 7a–d). Die Morphologie des Hornhautendothels blieb zwischen dem nicht injizierten Auge und dem injizierten Auge bei niedrigen, mittleren und hohen Dosen unverändert, was darauf hinweist, dass die CCPP-Expression die Endothelzellmorphologie nicht negativ beeinflusst (Abb. 7e – h).

Elektronenmikroskopische Schnitte aus jeder Dosierungsgruppe sowie ein nicht injiziertes Kontrollauge der Hochdosis-Ratte wurden auf qualitative Unterschiede in der Iris (a–d) und dem Hornhautendothel (e–h) analysiert. Während festgestellt wurde, dass die Hornhautendothelzellen unverändert waren, wurde in der Iris mit zunehmender Vektordosis eine fortschreitende Ausdünnung festgestellt. Vergrößerung = 2000×; Maßstabsbalken = 10 μm.

Da chronische Entzündungen mit einer Senkung des Augeninnendrucks in Verbindung gebracht werden66,67,68, wollten wir herausfinden, ob ein Zusammenhang zwischen der Bewertung der Zell-, Flare- oder Iris-Exfoliation und den Messungen des Augeninnendrucks nach rAAV2/2[MAX].CCPP-Vektorinjektion über alle Dosen hinweg besteht . Insbesondere wenn die nach rAAV2/2[MAX].CCPP beobachtete Senkung des Augeninnendrucks durch das Vorliegen einer chronischen Entzündung verursacht wird, wäre eine starke negative Korrelation zwischen hohen Entzündungswerten und einer Senkung des Augeninnendrucks zu erwarten. Lineare Regressionsanalysen zeigen keine signifikante Korrelation zwischen Zell- (r2 = 0,02555), Flare (r2 = 0,008490) oder Iris-Peeling (r2 = 0,000041; Abb. 8a–c). Um zu bestimmen, ob Entzündung und Vektordosis kovariante Modifikatoren des Augeninnendrucks sind, verglichen wir die Steigung der linearen Regressionen für jede Entzündungsmetrik (Zelle, Entzündung und Irisabschilferung) mit Augeninnendruckmessungen und trennten sie nach Vektordosis (niedrig; N = 9, mittel; N = 6 oder hoch; N = 5; ergänzende Abbildung 4). Ein mehrfacher Tukey-Vergleichstest ergab keinen signifikanten Unterschied in der Regressionssteigung zwischen den Dosen für irgendeinen Entzündungsindikator, einschließlich Zell- (p = 0,6316–0,6563), Flare (p = 0,06436–0,6669) oder Iris-Peeling (p = 0,6166–0,6994). Dies weist stark darauf hin, dass Augenentzündungen und die Dosierung des rAAV2/2[MAX].CCPP-Vektors keine Modifikatoren des Augeninnendrucks sind.

Lineare Regressionen, die den Augeninnendruck mit der Zell-, Entzündungs- und Irisablösung korrelieren (a–c), zeigen keinen Zusammenhang zwischen der Senkung des Augeninnendrucks und der beobachteten Entzündung in der Vorderkammer. Die Masson-Trichrom-Färbung, die auf eine kollagenbasierte Fibrose (blauer Farbstoff) hinweist, wurde in unbehandelten (d–f) und kontralateral behandelten Augen (g–i) qualitativ analysiert (Vergrößerung = 20-fach, Maßstabsbalken = 150 µm), wobei keine offensichtlichen Unterschiede zwischen den behandelten Augen festgestellt wurden und unbehandelte Augen in jeder Dosierung.

Um festzustellen, ob eine Fibrose oder Atrophie des Ziliarkörpers – die möglicherweise die Produktion von Kammerwasser und damit therapieunabhängig den Augeninnendruck senkt – offensichtlich war, wurde eine Immunhistochemie unter Verwendung von Masson-Trichrom, Hämatoxylin und Eosin (H&E) und Periodsäure Schiff durchgeführt (PAS). Die Masson-Trichrom-Färbung (Abb. 8d–i) ergab keine Hinweise auf eine erhöhte Fibrose (blauer Farbstoff) in rAAV2/2[MAX]. Mit CCPP behandelte Augen im Vergleich zu kontralateralen unbehandelten Kontrollaugen in jeder Dosierungsgruppe (Abb. 8d – i). Die H&E-Färbung (ergänzende Abbildung 5) und die PAS-Färbung (ergänzende Abbildung 6) zeigten bei keiner Dosierungsgruppe offensichtliche Unterschiede in der Ziliarkörpermorphologie zwischen behandelten und unbehandelten Augen, was auf das Fehlen einer Ziliarkörperatrophie hinweist.

Zusammengenommen deuten diese Daten stark darauf hin, dass die dosisabhängige Senkung des Augeninnendrucks, die nach der Behandlung mit rAAV2/2[MAX].CCPP beobachtet wurde, weder mit einer vektor- noch einer transgenvermittelten Entzündung verbunden ist, bei der es keine signifikante Korrelation zwischen Entzündungsmetriken, Dosis, und Druck. Darüber hinaus gab es keine Hinweise auf grobe anatomische Läsionen (Fibrose oder Atrophie) am Ziliarkörper, die auf eine erhebliche Verringerung der Kammerwasserproduktion hinweisen könnten.

Die Compliance der Patienten mit bestehenden pharmakologischen Therapien (z. B. Augentropfen) bei Offenwinkelglaukom ist aufgrund einer Kombination aus geringer Verträglichkeit, Schwierigkeiten bei der Selbstverabreichung und dem Fehlen einer unmittelbaren negativen Rückmeldung (z. B. Schmerzen) zur Verstärkung der richtigen Dosierung äußerst schlecht kommt es selbst bei frühzeitig diagnostizierten Patienten häufig zur Entwicklung sehbehindernder Komplikationen. Um die Nichteinhaltung der Therapie durch den Patienten zu reduzieren, die Sehergebnisse zu verbessern und die medizinische Belastung durch die Einhaltung eines täglichen Behandlungsplans zu verringern, besteht daher großes Interesse an der Entwicklung neuartiger Therapien, die den Augeninnendruck über einen längeren Zeitraum senken, einschließlich implantierbarer Arzneimittelgeräte und in jüngerer Zeit Gentherapie35,69,70,71. Hierin demonstrieren wir mithilfe einer Kombination aus multimodaler Bildgebung, Tonometrie, Elektrophysiologie und Post-Mortem-Histologie die Wirksamkeit und Sicherheit eines intrakameral injizierten rAAV-Vektors, der die De-novo-Biosynthese von PGF2α und seinem Rezeptor aus Zellen des Iridokornealwinkels und des Hornhautendothels katalysiert Dies führt zu einer dosisabhängigen, langfristigen (12 Monate) Senkung des Augeninnendrucks. Wichtig ist, dass wir zeigen, dass der Einschluss von Tetracyclin-responsiven Riboswitch-Elementen in das Expressionskonstrukt die vorübergehende Umkehrung der IOP-Reduktion durch die Ergänzung eines oralen aktivierenden Arzneimittels ermöglicht – ein wichtiges Sicherheitsmerkmal für die klinische Umsetzung, das entweder die Beendigung der Behandlung bei Auftreten von ermöglicht eine gleichzeitige Infektion (z. B. herpetische Keratitis) oder die Fähigkeit, die Gendosierung individuell auf das optimale Transgenexpressionsniveau anzupassen.

Unsere Daten zeigen, dass die Dosis ein Faktor für das Erreichen einer optimalen Senkung des Augeninnendrucks war und dass entscheidend ist, dass der Grad der Senkung des Augeninnendrucks in Gruppen mit mittlerer (−21,88 %) oder hoher Dosis (−43,22 %) dem Grad entsprach oder übertraf, der mit Strom erreicht wurde pharmakologische Ansätze, bei denen frühere Berichte über die Anwendung von Latanoprost beim Menschen eine durchschnittliche Senkung des Augeninnendrucks um 24–35 % nach 2 Jahren kontinuierlicher Behandlung zeigten15,72,73,74. Der klare dosisabhängige Zusammenhang zwischen der Anzahl der verabreichten Vektorgenome und der beobachteten Senkung des Augeninnendrucks ist von besonderer Bedeutung, da er darauf hinweist, dass die vorgeschlagene gentherapeutische Behandlung für OAG auf der Grundlage der Anforderungen einzelner Patienten personalisiert werden könnte. Obwohl die Dosierung ein wichtiger Faktor für das Erreichen der gewünschten Senkung des Augeninnendrucks ist, wurde interessanterweise auch festgestellt, dass die Anzahl der verabreichten Vektorgenome direkt mit unserer Fähigkeit korreliert, den Behandlungseffekt durch Aktivierung der im CCPP enthaltenen auf Tetracyclin reagierenden Riboschalterelemente TC40 und TC45 umzukehren Vektorgenom als zusätzliches Sicherheitsmerkmal46. Bei einer Tetracyclin-Diät zur posttranskriptionellen Herunterregulierung der Transgenexpression für einen Monat zeigten BN-Ratten in der Gruppe mit mittlerer Dosis eine nahezu Rückkehr zum Ausgangswert, wohingegen Tiere mit hoher Dosis nur eine teilweise Rückkehr zur Normotonie zeigten, was darauf hindeutet, dass es sich um ein begrenztes Ausmaß handelt dazu kann die Transgenexpression und damit die IOD-Reduktion mithilfe der aktuellen Iteration unserer Expressionskassette inaktiviert werden. Eine Möglichkeit dafür, dass bei den mit hoher Dosis behandelten Tieren keine vollständige Rückkehr zur Normotonie beobachtet wurde, könnte sein, dass eine anhaltende PGF2α-Biosynthese zu einer irreversiblen Umgestaltung des uveoskleralen Ausflusswegs führen könnte, obwohl dies weder im Licht- noch im Elektronenmikroskop sofort erkennbar war. Eine alternative Erklärung für die nur beobachtete teilweise Umkehrung ist der begrenzte dynamische Bereich der in dieser Studie verwendeten Tetracyclin-Riboschalter, wobei wir zuvor gezeigt haben, dass die TC45- und TC40-Elemente einen relativ kleinen dynamischen Bereich (ca. 4,6-fache Reduzierung) zwischen inaktiv und haben aktive Zustände und schalten die Transgenexpression nicht vollständig aus, was es wahrscheinlich macht, dass in hochdosierten Augen eine verbleibende PGF2α-Biosynthese vorhanden war, die ausreichte, um einen gewissen Grad an IOP-Reduktion aufrechtzuerhalten, selbst wenn sie einer Tetracyclin-Diät unterzogen wurden45. Sollte sich herausstellen, dass dies richtig ist, wäre es für zukünftige Studien und die klinische Umsetzung von Vorteil, Riboschalter mit einem größeren Dynamikbereich und einem niedrigeren Expressionsniveau im aktiven „Aus“-Zustand zu entwickeln. Angesichts der bekannten klinischen Nebenwirkungen im Zusammenhang mit der Langzeitanwendung von Tetracyclin (z. B. Darmdysbiose und Zahnverkalkung) und der wachsenden Bedenken im Zusammenhang mit Antibiotikaresistenzen sollte ein solcher neuartiger Riboschalter idealerweise so konzipiert sein, dass er auf einen aktivierenden Liganden reagiert, bei dem dies nicht der Fall ist ein Antibiotikum und hat eine höhere Bioverfügbarkeit als Tetracyclin, das nachweislich die Blut-Hirn-Schranke nur unzureichend passiert75,76. Es gibt mehrere alternative Riboschalter, darunter solche mit größerem dynamischen Bereich, einschließlich GuaM8HDV und TAP1, die auf Guanidin-HCL bzw. Theophyllin reagieren. Es ist jedoch nicht bekannt, ob diese Liganden leicht durch die Blut-Wasser-Schranke absorbiert werden45,46,77,78, 79,80.

Unsere Studie hat gezeigt, dass die Auswirkungen der Überexpression von CCPP-Transgenen offenbar weder die Morphologie noch die Funktion der Netzhaut negativ beeinflussen. Obwohl die cSLO- und OCT-Analyse nach 12 Monaten im Vergleich zum Ausgangswert eine erhöhte NIR und eine signifikante Netzhautverdünnung bei verschiedenen Exzentrizitäten des Sehnervs ergab, traten diese Veränderungen sowohl bei behandelten als auch bei unbehandelten Augen auf und waren unabhängig von der Dosis, wo niedrig dosierte Augen (und) behandelt wurden kontralaterale Kontrollen) zeigten eine stärkere Netzhautverdünnung als die mit mittlerer oder hoher Dosis behandelten Tiere. Da es keinen klaren dosisabhängigen Zusammenhang zwischen unserer CCPP-Therapie und einem erhöhten Reflexionsvermögen oder einer Netzhautverdünnung gibt, gehen wir davon aus, dass die beobachteten Veränderungen mit der normalen Alterung zusammenhängen, bei der bereits früher eine Verdünnung der Netzhaut, insbesondere der Nervenfaserschicht der Netzhaut, beobachtet wurde korrelieren mit zunehmendem Alter in Menschen-, Maus- und Rattenmodellen54,55,56,57,58,59,60. Wichtig ist, dass die durch ffERG beurteilte Netzhautfunktion in keiner Dosisgruppe und bei keinem Beleuchtungsparameter beeinträchtigt wurde. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die intrakamerale Verabreichung von rAAV2/2[MAX].CCPP und die De-novo-Biosynthese von PGF2α gut verträglich sind und die Gesundheit oder Funktionalität der Netzhaut nicht beeinträchtigen, wobei unbehandelte und behandelte Augen in jeder Dosiskohorte einen ähnlichen Grad aufweisen mit erhöhtem Reflexionsvermögen und Netzhautverdünnung und ohne dass durch ffERG funktionelle Defizite beobachtet wurden.

Eine unserer Hauptüberlegungen bei der Bewertung der Wirksamkeit der vorgeschlagenen Gentherapie zur Senkung des Augeninnendrucks war die Beurteilung der Gesundheit der Vorderkammer nach intrakameraler Vektorverabreichung und längerer Expression des CCPP-Transgens. Es wurde festgestellt, dass die Hornhautdicke zwischen unbehandelten und behandelten Augen nach 12 Monaten unverändert war, was darauf hindeutet, dass unsere gentherapeutische Behandlung die Gesundheit der Hornhaut nicht beeinträchtigt und dass die während der Studie durchgeführten Augeninnendruckmessungen nicht durch Veränderungen der Hornhautdicke verfälscht worden wären jede Dosisgruppe. Darüber hinaus ergab die EM, dass das Hornhautendothel, die Descemet-Membran und das Stroma eine normale Morphologie aufwiesen, ohne dass Anzeichen von Ödemen, Ausdünnung oder Delamination festgestellt wurden, was darauf hinweist, dass die Integrität der Hornhaut und des Endothels nicht beeinträchtigt war. Interessanterweise beobachteten wir eine signifikante und dosisabhängige Zunahme der Vorderkammertiefe, ein Befund im Gegensatz zu früheren Studien, die darauf hindeuteten, dass die Behandlung mit Prostaglandin-Analoga zu einer Verringerung der Vorderkammertiefe führt81,82. Diese Studien befassten sich jedoch nur mit kurzfristigen Auswirkungen der Anwendung von Latanoprost und Pilocarpin bei Glaukompatienten, bei denen als direkte Folge eines erhöhten IOD82 davon ausgegangen werden kann, dass die Tiefe der Vorderkammer tiefer ist als bei alters- und geschlechtsangepassten Kontrollpersonen. Daher ist es möglich, dass die in dieser Studie beobachtete Vertiefung der Vorderkammer ein Artefakt der Verwendung von normotensiven Tieren während der gesamten Studie ist, bei denen zu erwarten wäre, dass sie normale Grundlinienkrümmungen der Hornhaut aufweisen und daher bei einem Augeninnendruck deutliche Veränderungen der Kammertiefe zeigen können durch gentherapeutische Behandlung künstlich gesenkt werden. Alternativ ist es auch möglich, dass die De-novo-Biosynthese von PGF2α in der Vorderkammer selbst zu einer umfassenderen uveoskleralen Umgestaltung führt, als wenn Prostaglandin-Analoga topisch auf die Hornhautoberfläche aufgetragen werden, da nur 5–10 % jedes Tropfens aufgenommen werden die Hornhaut und der Rest wird vom umliegenden Gewebe falsch absorbiert83,84,85,86. Es bleibt jedoch unklar, durch welchen Mechanismus die anhaltende intraokulare Biosynthese von PGF2α die Tiefe der Vorderkammer beeinflusst, obwohl die OCT zu zeigen scheint, dass die zentrale Hornhaut von Augen mit hoher Dosis stärker gekrümmt ist, was darauf hindeutet, dass die Hornhaut eher „ausgewölbt“ ist Linse und Iris haben sich nach hinten bewegt. Neben der stärker als erwünschten Senkung des Augeninnendrucks in den Augen mit hoher Dosis ist auch die Vertiefung der Vorderkammer besorgniserregend, da sie sich wahrscheinlich negativ auf das Sehvermögen des Patienten auswirken würde, wo frühere Studien gezeigt haben, dass nach dem Einsetzen einer IOL bei Kataraktpatienten die vordere Augenkammer beeinträchtigt wird Eine Vergrößerung der Kammertiefe um 1 mm kann zu einer kurzsichtigen Verschiebung der Brechungsfehler führen, die bis zu 0,32 Dioptrien ansteigt87,88.

Die von maskierten Beobachtern durchgeführte Zell- und Flare-Bewertung ergab keinen signifikanten dosisabhängigen Anstieg der Entzündung, was darauf hindeutet, dass die Injektion von rAAV in die Vorderkammer und die langfristige Expression der CCPP-Transgenkassette gut vertragen werden. Umgekehrt wurde zwar festgestellt, dass die Entzündung der Vorderkammer vernachlässigbar war, eine Irisdispersion wurde jedoch in allen Dosierungsgruppen beobachtet, wobei Tiere mit hoher Dosis ein hochsignifikantes Ausmaß an Melanozytenmigration zeigten, das stark mit der Ausdünnung der Iris korrelierte, wie durch Elektronenmikroskopie beurteilt. Anhand der vorliegenden Studie lässt sich nicht feststellen, ob die dosisabhängige Exfoliation der Iris auf die direkte Expression des CCPP-Transgens in Melanozyten zurückzuführen ist, wo der Serotyp rAAV2/2[MAX] in der Lage ist, Zellen der Iris zu transduzieren, oder ob dies der Fall ist im Zusammenhang mit steigenden Konzentrationen von PGF2α in der Vorderkammer bei höheren Vektordosen. Unabhängig davon würde die Beobachtung einer dosisabhängigen Pigmentdispersion wahrscheinlich eine Kontraindikation für die Verwendung der beschriebenen rAAV.CCPP-Gentherapie zur Senkung des Augeninnendrucks bei Patienten mit angeborenem (z. B. Axenfeld-Rieger) oder Pigmentdispersionsglaukom darstellen, deren Iris möglicherweise bereits instabil ist Der Abbau kann entweder durch Transduktion der Iris mit AAV oder durch Expression des CCPP-Transgens und Biosynthese von PGF2α beschleunigt werden. Angesichts der fehlenden Beteiligung der Iris an der Pathophysiologie der Augenhypertonie bei OAG (im Gegensatz zum Engwinkelglaukom oder angeborenem Glaukom) wäre es jedoch wahrscheinlich von Vorteil, die Auswahl natürlich vorkommender oder manipulierter rAAV-Serotypen zu untersuchen, auf die die Iris nicht übertragen wird Eliminieren Sie die Möglichkeit, dass die direkte CCPP-Expression bei der Behandlung von OAG oder Pigmentdispersionsglaukom eine Irisablösung verursacht.

Ein weiteres wichtiges Anliegen bei der Bewertung der Wirksamkeit einer gentherapeutischen Behandlung, die durch Modulation der Signalwegbiologie zur Synthese von PGF2α de novo aus Zellen der Vorderkammer funktioniert, ist die Frage, ob eine beobachtete Verringerung des Augeninnendrucks nicht auf die pharmakologische Wirkung von PGF2α auf den uveoskleralen Umbau zurückzuführen ist , sondern durch chronische Entzündung als Reaktion auf die Injektion von rAAV-Virionen in die Vorderkammer oder die anschließende Expression des therapeutischen Transgens. Diese Sorge ist besonders relevant bei der Bewertung einer neuartigen Behandlung des Glaukoms, bei dem eine anhaltende, geringgradige Entzündung bekanntermaßen den Augeninnendruck bei menschlichen Patienten senkt und daher auch in experimentellen Tiermodellen wie der Brown-Norwegen-Ratte eine Störvariable darstellen kann66,67 ,68. Durch die Durchführung einer Reihe linearer Regressions- und Kovarianzanalysen konnten wir erfolgreich zeigen, dass die Vektordosis (niedrig, mittel oder hoch) und die Schwere der Entzündung (abgestuft nach Zell-, Entzündungs- und Irisablösung) keine signifikanten Mediatoren der IOP-Reduktion sind Dies weist stark darauf hin, dass die beobachtete dosisabhängige Senkung des Augeninnendrucks in allen Behandlungsgruppen in erster Linie durch die biologische Wirkung des zugeführten CCPP-Transgens vermittelt wurde. Tatsächlich war die einzige Regressionsanalyse, die sich statistischer Signifikanz näherte, die Beziehung zwischen Iris-Peeling und Augeninnendruck in der Hochdosis-Behandlungsgruppe (ergänzende Abbildung 4I), die zu einer positiven Steigung tendiert, wobei eine höhere Entzündungsbewertung mit einem höheren Augeninnendruck korreliert; der genau entgegengesetzte Trend zu dem, der erwartet wurde, wenn eine chronische Entzündung für die in dieser Studie beobachtete Senkung des Augeninnendrucks verantwortlich wäre.

Eine Einschränkung dieser Arbeit besteht darin, dass unbehandelte Kontrollaugen in allen Dosiskohorten kontralateral zu injizierten Augen waren. Insbesondere haben Studien gezeigt, dass die Injektion von rAAV in ein Auge Auswirkungen auf das kontralaterale Auge haben kann, wie in vorklinischen Studien zur Leberschen kongenitalen Amaurose beobachtet wurde, bei denen virale DNA sowohl in der injizierten als auch in der nicht injizierten Vorderkammer, der Netzhaut und den Sehnerven gefunden wurde nichtmenschliche Primaten nach intravitrealer Vektorinjektion89. Dies erhöht die Möglichkeit, dass die in unserer Studie beobachteten Veränderungen des Reflexionsvermögens und der Dicke der Netzhaut auf Übersprechen zwischen dem injizierten und dem kontralateralen nicht injizierten Auge zurückzuführen sind und nicht auf eine normale Alterung zurückzuführen sind. Wir glauben jedoch, dass dies aus folgenden Gründen unwahrscheinlich ist: (1) Die CCPP-Expression und die PGF2α-Produktion reichten in Niedrigdosisgruppen nicht aus, um den Augeninnendruck im behandelten Auge selbst zu verändern, und daher erscheint es unlogisch, dass eine derart niedrige Aktivität vorliegt könnte die Gesundheit der Netzhaut im kontralateralen, nicht injizierten Auge beeinträchtigen; (2) Es wurde weder bei behandelten noch bei unbehandelten Augen beobachtet, dass ein erhöhtes Reflexionsvermögen und eine Verdünnung der Netzhaut dosisabhängig waren, was zu erwarten wäre, wenn beides auf das Vorhandensein von Vektorgenomen oder die Expression von PGF2α im kontralateralen Auge zurückzuführen wäre, wo es wiederum zu Übersprechen kommen würde Es ist zu erwarten, dass sie bei mit hoher Dosis behandelten BN-Ratten am größten ist. (3) Frühere Studien haben gezeigt, dass die mittlere Vorderkammertiefe bei BN-Ratten 778 ± 42,7 Mikrometer beträgt, was unseren 12-Monats-Ergebnissen in unbehandelten Augen über alle Dosen hinweg ähnelt;90 (4) das für die Elektronenmikroskopie-Studie vorgestellte Kontrollauge wurde von einer mit hoher Dosis behandelten Ratte gewonnen und zeigte keine nachteiligen morphologischen Veränderungen (z. B. Abblättern/Ausdünnen der Iris), die zu erwarten gewesen wären, wenn es zu einer Überschneidung zwischen den injizierten und nicht injizierten Augen gekommen wäre.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Behandlung von normotensiven Brown-Norway-Ratten mit rAAV2/2[MAX].CCPP zu einer dosisabhängigen Senkung des Augeninnendrucks führte, wobei Augen mittlerer Dosis eine klinisch relevante Senkung der Augenhypertonie aufwiesen, ohne dass es zu unerwünschten Nebenwirkungen kam. Entscheidend ist, dass die Senkung des Augeninnendrucks durch die Verabreichung eines oralen Liganden rückgängig gemacht werden könnte, ein entscheidendes Sicherheitsmerkmal für die klinische Umsetzung, das eine vorübergehende Unterbrechung der Behandlung im Falle einer Nebenwirkung oder der Notwendigkeit der Beseitigung einer Kommensalinfektion ermöglicht. Während bei mit hoher Dosis behandelten BN-Ratten eine Irisablösung und eine Vertiefung der Vorderkammer beobachtet wurde, zeigten diese Tiere auch eine stärkere als klinisch relevante IOD-Reduktion und scheinen daher eine Überdosierung des rAAV2/2[MAX].CCPP-Vektors darzustellen . Zukünftige Forschungen zur Bestimmung der Auswirkungen dieser Therapie in glaukomatösen Tiermodellen sowie zur Entdeckung der optimalen Kombination aus Vektorkapsidtropismus und abstimmbarem Riboschalter zur Begrenzung der beobachteten Nebenwirkungen bei hohen Vektordosen würden die Übersetzbarkeit der beschriebenen, langwirksamen Einzeltherapie erhöhen Verwenden Sie eine Gentherapie zur Behandlung des Offenwinkelglaukoms.

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Medical College of Wisconsin genehmigt und entsprechen der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung. 6–8 Wochen alte BN-Ratten (N = 30: 15 männlich und 15 weiblich) wurden von Charles River Laboratories (BN/Crl, Wilmington, MA, USA) erhalten und in einer 12:12-Stunden-Hell/Dunkel-Photoperiode gehalten Nahrung und Wasser werden nach Belieben bereitgestellt. Zusätzlich wurden 3 BN-Ratten für Tropismusexperimente gewonnen. Für Untersuchungen, die eine Vollnarkose erforderten, wurden die Tiere in eine Induktionskammer (VetEquip, Livermore, CA) gebracht und durch Inhalation von Isofluran (5 % Einleitung, 1–2,5 % Erhaltung) in Sauerstoff (100 %, 0,2–1 l/min) sediert ). Die Pupillenerweiterung wurde durch die Platzierung topischer mydriatischer Augentropfen mit 2,5 % Phenylephrin-HCL und 1 % Tropicamid (Akorn, Lake Forest, IL, USA) erreicht.

HEK293T-Zellen (ATCC-Nr. CRL-11268; Manassas, VA, USA) wurden in DMEM + Glutamax mit hohem Glucosegehalt (Gibco Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Antibiotika-, kultiviert. antimykotisch. Die Zellen wurden in Platten mit sechs Vertiefungen in einer Dichte von 3,0 × 105 Zellen/Vertiefung ausgesät und dann mit Polyethylenimin (PEI) (Polysciences, #23966-100, PA, USA) bei ~70 % Konfluenz mit 2 µg smCBA-TC40 transfiziert. COX2-P2A-PTGFR-TC45-Plasmid in reduziertem Serum (2 %) DMEM + Glutamax-Medium. Nach 72 Stunden wurde das Medium aus den Vertiefungen geerntet und in Duplikaten unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Kits analysiert, um die PGF2α-Spiegel zu quantifizieren (Abcam, ab133056, Cambridge, Vereinigtes Königreich).

Kurz gesagt, HEK293T-Zellen wurden einer dreifachen Transfektion unterzogen mit (1) einem Plasmid, das Rep- und Cap-Gene für den Kapsidmutanten-rAAV2/2[MAX]-Vektor exprimiert; (2) ein Helferplasmid, das von Adenoviren abgeleitete Gene exprimiert, die für die Verpackung erforderlich sind; und (3) das Transgen-Expressionsplasmid (smCBA-TC40-COX2-P2A-PTGFR-TC45; Sequenzinformationen siehe Patentnummer US20200063137A1) in äquimolaren Verhältnissen (1:1:1) unter Verwendung von PEI52. Die Zellen wurden 72 Stunden nach der Transfektion in DMEM + Glutamax mit 2 % FBS und 1 % Antibiotikum-Antimykotikum in Hyperflaschen (Corning, Corning, NY) kultiviert. Nach 72 Stunden wurde der Vektor durch Iodixanol-Dichtegradientenzentrifugation und Konzentration durch Pufferaustausch gereinigt, wie zuvor beschrieben91,92. Anschließend wurden insgesamt 5 Vektorpräparate von rAAV2/2[MAX]-smCBA-TC40-COX2-PTGFR-TC45 kombiniert und durch Pufferaustausch in einer 100-kDa-Filtersäule konzentriert, um die Virustiter zu erhöhen (Amicon, Darmstadt, Deutschland). Die rAAV-Titer wurden durch einen PicoGreen-Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) bestimmt, der 240 μl von 3,9 × 1013 vg/ml (Vektorgenome/ml) ergab93. Die Vektoren wurden in HBSS + 0,014 % Tween-20 verdünnt, um eine dreifache Dosissteigerung für die Injektion zu ermöglichen: 3,9 × 109 vg/Auge (niedrig), 3,9 × 1010 vg/Auge (mittel) und 3,9 × 1011 vg/Auge ( hoch). Für In-vivo-Tropismusexperimente wurde ein einzelnes Vektorpräparat von rAAV2/2[MAX]-smCBA-mCherry ähnlich dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt, was 80 μl von 1,17 × 1013 vg/ml ergab.

Dreißig BN-Ratten wurden anästhesiert und ihre Pupillen erweitert, bevor sie eine einseitige intrakamerale Injektion von rAAV2/2[MAX]-smCBA-TC40-COX2-P2A-PTGFR-TC45 entweder mit niedriger (3,9 × 109 vg) oder mittlerer (3,9 × 1010) erhielten vg) oder hohe (3,9 × 1011 vg) Dosis, suspendiert in 10 μl HBSS + 0,014 % Tween 20 mit einer kleinen Menge Fluorescein, um den Reflux sichtbar zu machen. Kurz gesagt, unter einem ophthalmologischen Operationsmikroskop (Leica, Wetzlar, Deutschland) wurde ein 6 mm rundes Glasdeckglas (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA) über der Hornhautoberfläche positioniert und mit Gleitgel (2,5 % Hypromellose, Akorn, Lake Forest, IL, USA), bevor die Spitzen einer 0,12 mm gekerbten geraden Pinzette (#0109025, Haag-Streit John Weiss, Vereinigtes Königreich) nach hinten zum Augapfel vorgeschoben wurden, um einen extraokularen Muskel zu sichern und eine Augenrotation zu verhindern. Anschließend wurde eine 10 mm lange, abgeschrägte 33-G-Nadel, die an einer 100-μl-Hamilton-Spritze befestigt war, etwa 1 mm vor dem Limbus durch die Hornhaut vorgeschoben, bis sich die Nadelspitze in der Mitte der Vorderkammer befand. Nach der Injektion von 10 μl gereinigtem Vektor wurde die Nadelspitze in Position gehalten, bis sich der Augeninnendruck stabilisiert hatte – sichtbar durch die Beseitigung des Hornhautstromas und die Wiederaufnahme der normalen Netzhautperfusion –, um übermäßigen Reflux zu begrenzen. In ähnlicher Weise erhielten drei BN-Ratten bilaterale intrakamerale Injektionen von rAAV2/2[MAX]-smCBA-mCherry für In-vivo-Tropismusexperimente und erhielten jeweils 1,13 × 1011 vg.

Der Augeninnendruck wurde mit einem tragbaren TonoLab-Rebound-Tonometer (iCare, Oy, Finnland) gemessen, das für die Verwendung bei Ratten zu Studienbeginn und 1, 2, 6, 9, 12 und 13 Monate nach der Injektion kalibriert war. Alle Messungen wurden an nicht betäubten Tieren innerhalb eines definierten Zeitraums (11:00–13:00 Uhr) durchgeführt, um die zirkadianbedingte Variabilität des Augeninnendrucks zu begrenzen. Alle an der Durchführung von IOD-Messungen beteiligten Untersucher wurden hinsichtlich der Vektordosis maskiert. Kurz gesagt wurde das Tonometer mithilfe eines Retortenständers in horizontaler Position befestigt und die Ratte wurde unter sanfter körperlicher Zurückhaltung so positioniert, dass das Testauge etwa 1 mm entfernt und senkrecht zur Tonometersonde ausgerichtet war. Jede IOD-Messung ist der Durchschnitt aus drei unabhängigen Aufzeichnungen. Nach Abschluss der Bewertung wurden die Ratten mit Bacon Yummies-Leckereien (Bio-Serv, Flemington, NJ, USA) belohnt, um sie auf die Handhabung ohne Betäubung vorzubereiten.

Die Tiere wurden vorläufigen und 12-monatigen Fundusuntersuchungen mit einem benutzerdefinierten Multiline-cSLO (modifiziertes Spectralis HRA; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Deutschland) unterzogen. Nach der Pupillenerweiterung wurde die Kameraausrichtung durch die Verwendung des Nahinfrarot-Reflexionsbildgebungsmodus (820 nm) erleichtert, wodurch sichergestellt wurde, dass das Fundusbild gleichmäßig beleuchtet und die Papille richtig zentriert war. Bei den aufgenommenen Bildern handelt es sich um Einzelbilder.

Nach 12 Monaten wurden alle Tiere einer Spaltlampen-Biomikroskopie (Topcon SL-D8Z, Topcon Medical Systems, Oakland, CA, USA) unterzogen, wobei Bilder von behandelten und unbehandelten Augen mit einer Digitalkamera (D810, Nikon, Japan) aufgenommen wurden. Zur Beurteilung von Zellen und Streulicht wurde ein Spaltlampenbild mit einem 1-mm-Spaltstrahl erstellt, der den Durchmesser des Augapfels abdeckte, und die Irisablösung wurde anhand von Weitfeldbildern beurteilt, die mit einem 20-mm-Strahl aufgenommen wurden. Zur Bewertung wurden Spaltlampenbilder anonymisiert und fünf unabhängigen Bewertern in zufälliger Reihenfolge vorgelegt, um sicherzustellen, dass die Bewerter sowohl hinsichtlich der Vektordosis als auch der Tieridentität maskiert waren. Die Einstufung erfolgte nach dem SUN-Einstufungsschema für Vorderkammerzellen und -flackern sowie einem modifizierten Hackett-McDonald-Einstufungsschema für Iris-Peeling (Ergänzungstabelle 1).

BN-Ratten wurden zu Studienbeginn und 12 Monate nach der Injektion einer Elektroretinographie-Untersuchung unterzogen. Die Ratten wurden über Nacht an die Dunkelheit angepasst und alle experimentellen Manipulationen wurden unter schwacher roter Beleuchtung durchgeführt. Für die Aufnahme wurde ein Espion E2-System verwendet, das an einen Color Dome (Diagnosys LLC, Cambridge, UK) mit Bessel-Filtern für 0, 1000 und 60 Hz angeschlossen war und in einem Faradayschen Käfig positioniert war, um elektrisches Rauschen zu reduzieren. Nach der Anästhesierung mit Isofluran wurden die Ratten auf einen beheizten Tisch gestellt, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten, während Refresh-befeuchtende Augentropfen auf die Hornhäute aufgetragen wurden, um die Hydratation aufrechtzuerhalten und für elektrische Leitfähigkeit zu sorgen. Subdermale Elektroden mit festem Kern wurden in die Kopfhaut und die Hüfte eingeführt und dienten als Referenz- bzw. Erdungselektroden, während Schleifenelektroden aus Golddraht auf der Hornhaut beider Augen angebracht wurden. Die Reaktionen wurden nach kurzen (4 ms) einzelnen (1 Hz) weißen Blitzreizen über eine 6-log-Luminanzreihe (-4 bis 0,48 log cd.s/m2) aufgezeichnet. A- und B-Wellen-Amplituden wurden mit der Espion E2-Software (Diagnosys LLC, Cambridge, UK) gemessen.

Bei BN-Ratten wurde zu Beginn und nach 12 Monaten eine retinale optische Kohärenztomographie (OCT) durchgeführt. Die Bildgebung wurde mit einem Bioptigen Envisu R2200 Spectral Domain OCT (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) durchgeführt, das mit einer Ratten-Retina-spezifischen Bohrung ausgestattet war. Es wurden rechteckige Volumenscans (1000 A-Scans/B-Scan, 650 B-Scans) der Netzhaut erstellt und Bilder mit installiertem OCT-Reader-Plugin in die FIJI-Software exportiert, wobei der Mittelwert aus 5 auf der Papille zentrierten Bildern gebildet wurde. Die resultierenden Bilder wurden dann in die OCT Reflectivity Analysis (ORA)-Software exportiert, wo Messungen der Netzhautdicke von der NFL bis zum RPE bei 10 Längsreflexionsprofilen bei 250-Mikrometer-Exzentrizitäten vom Sehnervenkopf aufgezeichnet wurden53. Die Vorderkammer-OCT wurde nach 12 Monaten mit dem R2200 OCT mit einer telezentrischen 12-mm-Bohrung abgeschlossen (1000 A-Scans/B-Scan, 650 B-Scans). Die aufgenommenen Bilder wurden mit Messschiebern für die Dicke der zentralen Hornhaut und die Tiefe der Vorderkammer in der Bioptogen InVivoVue-Software gemessen.

Ganze Kugeln, denen rAAV2.2[MAX]-mCherry injiziert wurde, wurden entkernt und über Nacht in 4 % Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C fixiert. Anschließend wurden die Augen 24 Stunden lang bei 4 °C in eine 30 %ige Saccharoselösung in PBS gegeben, bevor sie in PBS gespült und in Tissue-Tek-Medien mit optimaler Schnitttemperatur (Sakura, Torrance, CA) eingebettet wurden. OCT-Blöcke wurden dann auf einem Leica CM1860-Kryostat (Leica, Buffalo Grove, IL) in Schritten von 14 µm auf Fisherbrand Superfrost Plus-Objektträger geschnitten und über Nacht trocknen gelassen. Die Schnitte wurden bis zur Verwendung bei –20 ° C gelagert. Die Proben wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur aufgetaut, das OCT in PBS abgewaschen und die Schnitte mit Hoechst 33342 gegengefärbt, um die Kerne sichtbar zu machen. Die Schnitte wurden mit einem konfokalen Nikon Eclipse 80i-Mikroskop (Nikon, Minato, Tokio, Japan) unter Verwendung des 20-fachen Objektivs abgebildet und als Projektionen maximaler Intensität verarbeitet und in der FIJI-Software zusammengeführt.

Ganze Kugeln, denen der CCPP-Transgenvektor injiziert wurde, wurden über Nacht in 4 % PFA fixiert und das Gewebe durch abgestuftes Ethanol dehydriert, mit Xylol gereinigt, mit Paraffin infiltriert (Sakura Tissue Tek-VIP5; automatisierter Gewebeprozessor) und in Gewebeblöcke eingebettet (Tissue Tek-TEC). , Einbettungszentrum). Gewebeblöcke wurden auf 4 µm geschnitten (Microm HM355s) und auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger montiert. Die Schnitte wurden dann mit Xylol entparaffiniert, rehydriert und mit Hämatoxylin und Eosin unter Verwendung einer automatisierten Färbeplattform (Sakura Prisma) gefärbt und manuell auf Periodsäure-Schiff- und Masson-Trichrom gefärbt, wobei ein Standardprotokoll verwendet wurde, das vom Children's Research Institute Histology Core des Medical College of Wisconsin entwickelt wurde.

Ganze Kugeln aus jeder für die Transmissionselektronenmikroskopie vorgesehenen Dosierungsgruppe wurden entkernt und über Nacht bei 4 °C in 2 % Paraformaldehyd, 2 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer fixiert. Nach der Fixierung wurde die Dissektion der Bulben abgeschlossen, um Proben zu erhalten, die die Hornhaut, den Iridokornealwinkel und die vordere Netzhaut enthielten, und das Gewebe wurde in 1 % Osmiumtetroxid auf Eis nachfixiert. Nach der Postfixierung wurde das Gewebe in einer Methanolreihe (50–100 %) dehydriert und mit Acetonitril infundiert. Anschließend wurden Gewebeproben in 100 % Embed 812 (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA) eingebettet und über Nacht bei 60 °C gebacken. Eingebettete Proben wurden vom Medical College of Wisconsin Electron Microscopy Core verarbeitet, wo 70-nm-Schnitte mit einem PowerTome MT-XL-Ultramikrotom (RMC Boeckeler, Tucson, AZ, USA) erstellt und auf sechseckigen Gittern mit 200 Mesh (Electron Microscopy Science) platziert wurden gefärbt mit Uranylacetat und Bleicitrat. Gefärbte Schnitte wurden auf einem H-600-Transmissionselektronenmikroskop (Hitachi High Technologies, Schaumburg, IL, USA) bei 2000-facher Vergrößerung abgebildet.

Die gesamte statistische Analyse wurde in GraphPad Prism 7 (GraphPad, La Jolla, CA, USA) durchgeführt, um die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen zu bestimmen. Mithilfe eines Shapiro-Wilk-Tests wurde festgestellt, dass alle Datensätze normal waren (α = 0,05). Ungepaarte T-Tests wurden verwendet, um ELISA-, Kammertiefen- und Hornhautdickendaten zu analysieren. Eine Zwei-Wege-ANOVA mit Sidaks Post-Hoc-Mehrfachvergleichstest ergab signifikante Unterschiede in den Daten zur Netzhautdicke. Mehrere ungepaarte T-Tests wurden verwendet, um Unterschiede zwischen ERG-Daten zu bestimmen. Zur Analyse der IOD-Daten wurde eine Mixed-Effect-Analyse mit einem Dunnett-Mehrfachvergleichs-Post-hoc-Test und einer einfachen linearen Regression verwendet. Die Spaltlampendaten wurden mithilfe eines exakten Fisher-Tests analysiert. Um festzustellen, ob ein Zusammenhang zwischen der Senkung des Augeninnendrucks und der Entzündung erkennbar war, wurden einfache lineare Regressionen für Entzündungswerte im Vergleich zum Augeninnendruck nach 12 Monaten durchgeführt. Um zu testen, ob eine Entzündung ein Auslöser der IOD-Reduktion war, wurden außerdem lineare Regressionssteigungen für jede Dosierungsgruppe mit einem Tukey-Mehrfachvergleichstest verglichen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle zur Bewertung der Schlussfolgerungen in der Arbeit erforderlichen Daten sind in der Arbeit und/oder den ergänzenden Materialien enthalten. Die Rohdaten, die zur Generierung von IOP-, OCT-, ERG- und Spaltlampenzahlen verwendet werden, sind auf Figshare unter folgendem Link verfügbar: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21280383. Alle weiteren Wünsche können dem entsprechenden Autor mitgeteilt werden.

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Reid, CA & Lipinski, DM Rekombinante Adeno-assoziierte Virusproduktion und -reinigung im Klein- und Mikromaßstab für okuläre Gentherapieanwendungen. Methoden Mol. Biol. 1715, 19–31 (2018).

Piedra, J. et al. Entwicklung einer schnellen, robusten und universellen PicoGreen-basierten Methode zur Titration adeno-assoziierter Vektoren. Summen. Gene Ther. Methoden 26, 35–42 (2015).

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Clive Wells und Robert Goodwin vom Elektronenmikroskopie-Kern des Medical College of Wisconsin sowie Christine Duris und dem Team vom Histologie-Kern des Children's Research Institute für ihre Unterstützung bei der Verarbeitung und Bildgebung von Gewebe. Die Autoren danken auch Amira Pavlovich für ihre Unterstützung bei der IOP-Aufzeichnung. Die Autoren danken außerdem Ryan Conrardy, einem Biostatistiker des Medical College of Wisconsin, für seinen Beitrag zu Datenanalysen. Wir möchten außerdem Dr. Elena V. Semina und Dr. Michael J. Dunn dafür danken, dass sie die Finanzierung sichergestellt haben, die zur Unterstützung dieser Forschung beigetragen hat (Auszeichnungsnummer des National Eye Institute T32EY014537-EVS, National Eye Institute – R01EY032478 und National Center for Research Resources of). das NIH Research Facilities Improvement Program – C06RR016511-MJD).

Abteilung für Zellbiologie, Neurobiologie und Anatomie, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, USA

Kristina J. Chern, Christopher A. Reid und Daniel M. Lipinski

Abteilung für Augenheilkunde und visuelle Wissenschaften, Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI, USA

Kristina J. Chern, Emily R. Nettesheim, Christopher A. Reid, Nathan W. Li, Gavin J. Marcoe und Daniel M. Lipinski

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Konzeptualisierung: DML und CAR Methodik: DML, CAR, ERN und KJC Untersuchung: CAR, ERN, KJC, NWL und GJM Schreiben (ursprünglicher Entwurf): KJC und DML Schreiben (Überprüfung und Bearbeitung): KJC, CAR, ERN, DML , und GJM Aufsicht: DML Finanzierungseinwerbung: DML

Korrespondenz mit Daniel M. Lipinski.

Die Autoren erklären folgende Interessen: DML und CAR halten ein Patent für das in dieser Arbeit verwendete Transgen (CCPP). ERN, KJC, NWL und GJM haben keine konkurrierenden Interessen zu erklären.

Communications Biology dankt Mathias Seeliger und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Chiea Chuen Khor und Eve Rogers.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chern, KJ, Nettesheim, ER, Reid, CA et al. Prostaglandin-basierte rAAV-vermittelte Glaukom-Gentherapie bei Brown-Norwegen-Ratten. Commun Biol 5, 1169 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04134-w

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Eingegangen: 17. Januar 2022

Angenommen: 19. Oktober 2022

Veröffentlicht: 03. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04134-w

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Gentherapie (2023)

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