Die Kartierung menschlicher Norovirus-Antigene während einer Infektion zeigt die Breite der humoralen Immunantwort

npj Vaccines Band 8, Artikelnummer: 87 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Humane Noroviren (HuNoV) sind weltweit die häufigste Ursache für akute Gastroenteritis. Die humorale Immunantwort spielt eine wichtige Rolle bei der Beseitigung von HuNoV-Infektionen und die Aufklärung der Antigenlandschaft von HuNoV während einer Infektion kann Aufschluss über Antikörperziele geben, um das Impfstoffdesign zu beeinflussen. Hier verwendeten wir Jun-Fos-unterstütztes Phagendisplay einer Genombibliothek der HuNoV-Genogruppe GI.1 und Tiefensequenzierung, um gleichzeitig die Epitope von Serumantikörpern von sechs mit GI.1 HuNoV infizierten Personen zu kartieren. Wir fanden sowohl einzigartige als auch gemeinsame Epitope, die sowohl unter Nichtstrukturproteinen als auch unter dem Hauptkapsidprotein weit verbreitet waren. Wiederkehrende Epitopprofile deuten auf immundominante Antikörper-Fußabdrücke bei diesen Personen hin. Die Analyse der in Längsrichtung gesammelten Seren von drei Personen zeigte das Vorhandensein vorhandener Epitope in den Seren vor der Infektion, was darauf hindeutet, dass diese Personen zuvor HuNoV-Infektionen hatten. Dennoch tauchten sieben Tage nach der Infektion neu erkannte Epitope auf. Diese neuen Epitopsignale blieben 180 Tage nach der Infektion zusammen mit den Epitopen vor der Infektion bestehen, was auf eine anhaltende Produktion von Antikörpern hindeutet, die Epitope früherer und neuer Infektionen erkennen. Schließlich ergab die Analyse einer genomischen Phagendisplay-Bibliothek des GII.4-Genotyps mit Seren von drei mit dem GII.4-Virus infizierten Personen Epitope, die sich mit denen überlappten, die bei der GI.1-Affinitätsselektion identifiziert wurden, was auf das Vorhandensein einer GI.1/GII.4-Kreuzung schließen lässt -reaktive Antikörper. Die Ergebnisse zeigen, dass genomisches Phagen-Display in Verbindung mit Tiefensequenzierung HuNoV-Antigenlandschaften aus komplexen polyklonalen menschlichen Seren charakterisieren kann, um den Zeitpunkt und die Breite der menschlichen humoralen Immunantwort auf eine Infektion aufzudecken.

Humane Noroviren (HuNoVs) sind die Hauptursache sowohl für sporadische Fälle als auch für epidemische Ausbrüche von Gastroenteritis. Sie verursachen etwa 200.000 Todesfälle und verursachen eine weltweite wirtschaftliche Belastung von 60 Milliarden US-Dollar pro Jahr1,2,3. Noroviren (NoVs) gehören zur Familie der Caliciviridae und werden in 10 Genogruppen (GI-GX) und 49 Genotypen eingeteilt. Fünf NoV-Genogruppen (I, II, IV, VIII und IX), die 38 verschiedene Genotypen enthalten, sind in der Lage, Menschen zu infizieren4. Die große Sequenzvielfalt von HuNoVs führt zum Entweichen des Immunsystems und stellt ein potenzielles Hindernis für die Entwicklung eines allgemein schützenden Impfstoffs dar.

Das NoV-Genom ist eine einzelsträngige Positivsinn-RNA mit einer Länge von etwa 7,5 Kilobasen (kb), die in drei offene Leserahmen (ORFs) organisiert ist. ORF1 kodiert für ein großes Polyprotein, das in sechs nichtstrukturelle Proteine ​​verarbeitet wird, die an der Virusreplikation beteiligt sind, darunter NS1/2 (p48), NS3 (Nukleosidtriphosphatase oder NTPase), NS4 (p22), NS5 (VPg), NS6 (Protease) und NS7 (RNA-abhängige RNA-Polymerase oder RdRp). ORF2 und ORF3 kodieren die Haupt- (VP1) bzw. Nebenkapsidproteine ​​(VP2). Das Hauptkapsidprotein VP1 besteht aus einem kurzen N-terminalen Arm, einer Schalendomäne (S) und einer hervorstehenden Domäne (P). Die S-Domäne bewahrt die Integrität der NoV-Kapsidanordnung. Die P-Domäne bindet direkt an Histo-Blutgruppenantigene (HBGAs), um menschliche Zellen zu infizieren5,6. Die P-Domäne ist weiter in P1- und P2-Subdomänen unterteilt, wobei die P2-Subdomäne auf der äußeren Oberfläche freiliegt und in ihrer Sequenz sehr variabel ist, was das Entkommen einer Antikörperreaktion erleichtert7. Das Nebenkapsidprotein VP2 bindet an ein konserviertes Motiv in der VP1-S-Domäne. Seine Funktion bleibt unklar, obwohl es mit der viralen genomischen RNA im murinen NoV8 interagiert.

Die humorale Immunantwort gegen HuNoV-Infektionen spielt eine entscheidende Rolle bei der Virusbeseitigung und dem Schutz vor Folgeinfektionen6. Es gibt Hinweise darauf, dass die humorale Immunität bei der Beseitigung von HuNoV-Infektionen wirksamer und länger anhaltend ist als die T-Zell-Immunität9. Viele Epitope monoklonaler Antikörper (mAb) für HuNoV wurden identifiziert. In einer aktuellen Übersicht wurden über 70 veröffentlichte Studien zusammengefasst, in denen lineare und konformative Epitope beschrieben wurden, die sich größtenteils in VP1 befinden, für 307 einzigartige mAbs9. Obwohl die Kartierung von Epitopen in mAbs für ein rationales Impfstoffdesign von entscheidender Bedeutung ist, kann sie nicht die Gesamtheit der polyklonalen humoralen Immunantwort erfassen. Um ein umfassendes Verständnis der humoralen Immunität gegen Norovirus-Infektionen zu erlangen, ist die Identifizierung von Epitopen in polyklonalen menschlichen Seren erforderlich. In früheren Arbeiten wurden polyklonale menschliche Seren sowohl von HuNoV-infizierten Personen als auch von Teilnehmern an Impfstoffversuchen untersucht und das Vorhandensein einer schützenden Immunität und kreuzreaktiver Blockadeantikörper in diesen beiden Kohorten festgestellt10,11,12,13,14,15. Serum-HBGA-blockierende Antikörper nehmen nach HuNoV-Provokation und natürlichen Infektionen zu10,11,12,14. Eine weitere Studie untersuchte das serologische Repertoire prä- und postimmunisierter Seren von drei Teilnehmern einer bivalenten Impfstoffstudie und identifizierte einen weitgehend schützenden neutralisierenden Antikörper und sein kreuzreaktives Epitop15. Dennoch bleibt die umfassende HuNoV-Antigenlandschaft unvollständig. Eine umfassende Karte der HuNoV-Epitope würde einen systematischen Überblick über die humorale Immunantwort während einer HuNoV-Infektion liefern. Solche Karten könnten sich mit Fragen wie der Frage befassen, welche Epitope während einer HuNoV-Infektion erkannt werden, ob sich die Antigenlandschaft von HuNoV von Person zu Person unterscheidet, ob sich die Landschaft mit fortschreitender Infektion ändert und ob es unter HuNoVs konservierte und immundominante Epitope gibt.

Beim Phagendisplay werden Peptide oder Proteine ​​auf der Oberfläche des Bakteriophagenkapsids präsentiert16. Die angezeigten Peptide oder Proteine ​​sind im Genom jedes Phagenpartikels kodiert. Somit können große Peptidbibliotheken durch Affinitätsselektion und DNA-Sequenzierung auf Bindung an Zielproteine ​​untersucht werden17,18,19,20,21. Durch die Kartierung der Epitope für durch eine Infektion hervorgerufene Antikörper kann das Phagendisplay in Verbindung mit Next-Generation Sequencing (NGS) eine hochauflösende Ansicht der Epitoplandschaft während der humoralen Immunantwort liefern. Kürzlich wurden Technologien wie VirScan, das eine Bibliothek von Peptiden von 206 Virusarten verwendet, die auf einer T7-Phagenplattform in Verbindung mit NGS angezeigt werden, sowie eine Pan-Coronavirus-Phagendisplay-Bibliothek verwendet, um Immunantworten in Seren von COVID-Patienten zu profilieren um die Immunantworten gegen SARS-CoV-222,23,24 zu untersuchen.

Wir haben zuvor Phagen-Display-Affinitätsselektionen einer genomischen HuNoV-Phagen-Display-Bibliothek in Verbindung mit Tiefensequenzierung durchgeführt, um Epitope eines scFv-Antikörpers und polyklonaler Kaninchenseren gegen HuNoV25 zu identifizieren (Abb. S1). In dieser neuen Studie wollten wir das Repertoire der humoralen Immunantwort gegen HuNoV-Infektionen charakterisieren, indem wir Affinitätsselektionen in Verbindung mit einer Tiefensequenzierung an menschlichen Seren von mit HuNoVs infizierten Personen durchführten. Mithilfe unserer genomischen Phagen-Display-Bibliothek GI.1 Norwalk und einer neu erstellten genomischen Phagen-Display-Bibliothek GII.4 HOV haben wir zu einem einzigen Zeitpunkt nach der Infektion ein Profil von neun polyklonalen menschlichen Seren erstellt. Darüber hinaus haben wir eine Längsschnittstudie mit Seren von drei Personen sowohl vor der Infektion als auch zu mehreren Zeitpunkten nach der Infektion durchgeführt. Wir identifizierten Epitope in den Nichtstrukturproteinen NS1/2 (p48), NS3 (NTPase), NS4 (p22), NS5 (VPg), NS6 (Protease) und NS7 (RdRp) sowie kreuzreaktive Epitope im VP1-Hauptprotein Kapsidprotein, das nur bei GI.1 Norwalk oder GII.4 HOV vorkommt. Wir beobachteten, dass die Antigenlandschaften von Individuum zu Individuum variieren, aber auch häufig wiederkehrende Epitope enthalten. Wir haben auch die Veränderungen der Epitopprofile bei Einzelpersonen im Verlauf einer Infektion bestimmt. Diese Studien ergaben das Vorhandensein von Epitopen in den Seren vor der Infektion, was darauf hindeutet, dass die Personen frühere HuNoV-Infektionen hatten. 7 bis 30 Tage nach der Infektion entstanden neue Epitope in nichtstrukturellen und strukturellen Proteinen. Die meisten dieser Epitope blieben zusammen mit den Epitopen, die in den Seren vor der Infektion nachgewiesen wurden, 180 Tage nach der Infektion bestehen. Schließlich haben wir Epitope entdeckt, die bei GI.1 Norwalk und GII.4 HOV vorkommen, was das Vorhandensein von Antikörpern bestätigt, die zwischen Genogruppen kreuzreaktiv sind. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Phagen-Display in Verbindung mit Tiefensequenzierung Epitope in komplexen polyklonalen menschlichen Seren erfolgreich charakterisieren kann, was zu einem tieferen Verständnis der HuNoV-Immunantwort führt, was die Entwicklung von Screening-Methoden für HuNoV-Infektionen und eines allgemein schützenden Impfstoffs unterstützen kann.

Zuvor haben wir eine GI.1-gescherte genomische Phagen-Display-Bibliothek erstellt und diese zur Kartierung des Epitops eines menschlichen scFV-Antikörpers (Abb. S1) verwendet. Die Bibliothek wurde auch verwendet, um gleichzeitig mehrere Epitope aus polyklonalen Kaninchen-Antiseren zu kartieren, die gegen GI.1 Virus-Like-Particles (VLPs) erzeugt wurden25. Mehr als 450.000 Klone wurden gepoolt, um diese GI.1-Genombibliothek zu erstellen, die laut NGS sehr vielfältig ist und deren Inserts eine hervorragende Abdeckung der offenen Leserahmen von GI.1 aufweisen25.

In dieser Studie verwendeten wir erneut die GI.1-Bibliothek, um die Antigenlandschaft für eine HuNoV-Infektion abzubilden. Wir haben die Diversität der Inserts in der Bibliothek überprüft, indem wir NGS der Insertregion der naiven Bibliothek wiederholt haben, was die hohe Diversität der Bibliothek bestätigt (Abb. 1a, b). Das Klonieren der gescherten DNA in das Phagen-Display-Plasmid führt zu Insertionen entweder in Vorwärts- oder Rückwärtsorientierung in Bezug auf das GI.1-Genom. Beachten Sie, dass nur die Vorwärtsorientierungseinsätze In-Frame-HuNoV-Peptide kodieren. Wir zählten insgesamt sieben Millionen Vorwärtsstrang-Inserts und neun Millionen Rückwärtsstrang-Inserts in der Bibliothek. Die Inserts wurden mit dem Referenzgenom abgeglichen, um einen Coverage-Score pro Nukleotid zu erhalten26,27. Der Abdeckungswert wurde als Anzahl des Vorkommens jeder Nukleotidposition im Pool von Vorwärts- und Rückwärtsinserts berechnet, die auf das Referenzgenom ausgerichtet sind (Abb. 1c)28. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl für den Vorwärts- als auch für den Rückwärtsstrang mehrere Inserts für jede Nukleotidposition im Plasmid vorhanden sind, das das HuNoV-Genom enthält, was ein weiterer Hinweis auf eine hervorragende Abdeckung des Genoms durch Inserts ist (Abb. 1c). Die Größenverteilung der Inserts wurde ebenfalls berechnet und zeigt, dass Inserts Peptide mit einer Länge von 10 bis 170 Aminosäuren kodieren, wobei das durchschnittliche Insert 47 Aminosäuren kodiert (Abb. 1d). Der große Bereich der Peptidlängen sowie ihre kontinuierliche Verteilung legen nahe, dass sowohl lineare als auch konformative Epitope durch Inserts in der Bibliothek kodiert werden.

a Verteilung der Vorwärtsstrang-Inserts (rot) in der naiven Bibliothek, kartiert auf ihre Positionen im pKS-NV68 KM-Plasmid. Die Position des 5'-Endes des Inserts im pKS-NV68 KM-Plasmid ist auf der x-Achse dargestellt, während die Position des 3'-Endes des Inserts auf der y-Achse angegeben ist. Die Anzahl der Vorkommen der Einfügung wird als Anzahl auf der Z-Achse definiert. b Verteilung der Reverse-Strang-Inserts (schwarz) in der naiven Bibliothek. c Abdeckung der durch DNA-Sequenz-Alignments definierten naiven Bibliothek. Insgesamt wurden 7.498.441 Vorwärtsstrang-Inserts und 9.481.435 Rückwärtsstrang-Inserts ausgerichtet, um einen Coverage-Score pro Nukleotidposition zu generieren. Der Coverage-Score wurde als die Anzahl des Vorkommens jeder Nukleotidposition im Satz von DNA-Insert-Fragmenten definiert, die für die Vorwärtsstrang-Inserts bzw. Rückwärtsstrang-Inserts ausgerichtet waren. Die Coverage-Scores für die Vorwärtsstrang-Inserts von pKS-NV68 KM (rot) werden über der x-Achse angezeigt, während die Coverage-Scores für die Rückwärtsstrang-Inserts (grau) unterhalb der x-Achse angezeigt werden. d Verteilung der Peptidgröße in der naiven Bibliothek. Die Häufigkeit jedes einzelnen Peptids wird auf der y-Achse angezeigt, während die Peptidgröße auf der x-Achse angezeigt wird.

Um die Antikörperreaktion gegen HuNoVs während der Infektion zu profilieren, wurden Serumproben von GI.1-infizierten Personen für die Affinitätsselektion der genomischen Phagen-Display-Bibliothek GI.1 verwendet. Wir haben Seren von sechs Personen untersucht, die mit GI.1 HuNoV infiziert waren. Diese Seren wurden im Rahmen einer früheren Studie gesammelt29,30. Affinitätsselektionen wurden an Seren von vier Personen 14 Tage nach der Infektion und zwei Personen 30 Tage nach der Infektion durchgeführt. Affinitätsselektionen wurden durchgeführt, indem zunächst Antikörper in den Seren mit Protein A/G-Magnetkügelchen immobilisiert wurden. Die naive Phagenbibliothek wurde zu den immobilisierten Antikörpern hinzugefügt, um die Bindung zu ermöglichen. Nach zwei Runden der Affinitätsselektion wurden die gebundenen Phagen eluiert und die Insertregion wurde PCR-amplifiziert. An den PCR-Produkten wurde eine Tiefensequenzierung durchgeführt, um die Verteilung der Inserts bei Ausrichtung auf die Plasmidsequenz zu beurteilen, die die HuNoV-ORFs enthält (Abb. 1). Die Ergebnisse für die Person 715 sind in Abb. 2 dargestellt und die Ergebnisse für alle sechs Personen sind in Abb. S2 dargestellt.

Die x-Achse bezeichnet das 5′-Ende der Einsätze, die y-Achse das 3′-Ende der Einsätze und die z-Achse die Anzahl der Vorkommen. Die Verteilung der Insert-Cluster definiert die Anti-GI.1-Epitope in a NS1/2 (p48), b NS3 (NTPase), c NS4 (p22), d NS5 (VPg), e NS6 (Protease) und f NS7 ( RdRp).

Epitope wurden aus den Deep-Sequencing-Daten identifiziert, basierend auf der Verteilung der Inserts, ausgedrückt als Zählzahlen, die auf das HuNoV-Genom kartiert wurden, mit der Prämisse, dass die Zählzahlen proportional zum Ausmaß der Anreicherung durch Antikörper in den Seren sind25,27. Die Verteilung der Inserts und die damit verbundenen Abdeckungswerte nach zwei Runden der Affinitätsselektion mit Seren der infizierten Personen zeigten ein breites Spektrum an Signalen, die Epitope darstellen, die sich im VP1-Kapsidprotein sowie in mehreren nichtstrukturellen Proteinen befinden (Abb. S2).

Die genomische Phagen-Display-Bibliothek wurde durch Ligation zufällig gescherter genomischer DNA in das Phagen-Display-Plasmid konstruiert. Da die genomischen Inserts in beiden Orientierungen (vorwärts oder rückwärts) und in jedem der drei Leserahmen vorliegen können, liegen die meisten Inserts in der naiven Bibliothek außerhalb des Leserahmens und produzieren kein HuNoV-Peptid. Wenn die Affinitätsselektion eine Anreicherung für HuNoV-Peptide bewirkt, die von Antikörpern in Seren erkannt werden, sollte die Häufigkeit von Inserts, die In-Frame-Peptide kodieren, mit den folgenden Selektionsrunden zunehmen, während Inserts, die Out-of-Frame-Sequenzen kodieren, eliminiert werden sollten. Wie in Abb. S3a zu sehen ist, kodieren etwa 20 % der Inserts in der naiven Bibliothek In-Frame-Peptide, wie es für zufällige Inserts erwartet wird, während in Runde 2 der Selektion festgestellt wurde, dass 70–90 % der Inserts In-Frame-Peptide kodieren Peptide, während Inserts, die Out-of-Frame-Sequenzen codieren, weitgehend eliminiert wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Affinitätsselektion HuNoV-Sequenzen anreicherte, die in Seren vorhandene Antikörper, dh Epitope, binden. Wir haben auch den Anteil der In-Frame-Einfügungen für jede Zählnummer analysiert. Abbildung S3b zeigt, dass der Anteil der In-Frame-Einfügungen in der naiven Bibliothek für jede Einfügungsanzahlgruppe konstant bei 20 % blieb, was dem entspricht, was wir für den Gesamtanteil der In-Frame-Einfügungen beobachtet haben. Außerdem haben wir beobachtet, dass die Häufigkeit von In-Frame-Einfügungen in den Bibliotheken nach der Auswahl bei Einfügungen mit einer Anzahl von fünf zuzunehmen beginnt. Dies legt nahe, dass In-Frame-Inserts mit einer Anzahl von fünf oder mehr für durch Affinitätsselektion angereicherte Peptide, also Epitope, kodieren. Daher wurden In-Frame-Inserts mit einer Anzahl von fünf oder mehr in den Bibliotheken nach der Auswahl ausgewählt, um die Abdeckungswerte pro Nukleotidposition zu berechnen, wie oben für die naive Bibliothek beschrieben.

Um die Tiefe der Sequenzierung zu veranschaulichen und wie die Sequenzen, aus denen jedes Epitop besteht, wiederholt durch die Antikörper in den Seren angereichert werden, ist in den Abbildungen die Abdeckungskarte für Studienteilnehmer 715 als Beispiel dargestellt. 3 und S4. Die Abdeckungskarte zeigt, dass sich die Epitope in ORF1 als In-Frame-Aminosäuresequenzen in NS1/2 (p48), NS3 (NTPase), NS4 (p22), NS5 (VPg), NS6 (Protease) und NS7 (RNA) befinden -abhängige RNA-Polymerase oder RdRp). Die Abdeckungskarte zeigt auch das Vorhandensein von Epitopen im VP1-Kapsidprotein (in Abb. 3 und S4 nicht markiert). Die durch die Coverage-Scores aufgedeckten Epitope können mit höherer Auflösung aufgelöst werden, indem die Sequenzen, die mit Regionen mit hohen Coverage-Scores verknüpft sind, ausgerichtet werden, um Epitope bei der Auflösung einzelner Aminosäuren genau zu definieren (Abb. 3 und S4). Beispielsweise ergab die Ausrichtung der mit NS4 assoziierten Sequenzen ein 100 Aminosäuren langes Epitop. Da lineare Epitope weniger als 20 Aminosäuren lang sind31, ist das NS4-Epitop wahrscheinlich konformationell (Abb. 3, S4, Tabelle S1). Ausrichtungen von Sequenzen aus Regionen mit hoher Abdeckungsbewertung dieser Person lieferten in ähnlicher Weise eine hochauflösende Definition anderer Epitope, wie in Abb. 3 und Tabelle S1 dargestellt. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass der Ansatz der Affinitätsselektion und Tiefensequenzierung mehrere Epitope gleichzeitig und mit hoher Auflösung aus einer einzigen polyklonalen Serumprobe identifizieren kann.

Die Bedeckung der Inserts nach zwei Runden der Affinitätsselektion mit Seren von Subjekt 715 wurde durch DNA-Sequenz-Alignment mit dem Plasmid, das GI.1-ORFs enthält, bestimmt und ist links dargestellt. Der Pro-Nukleotid-Coverage-Score wird auf der y-Achse angezeigt, während die Position auf der Plasmidsequenz auf der x-Achse angezeigt wird. Als Referenz sind unterhalb der x-Achse die Positionen der HuNoV-ORFs 1 bis 3 dargestellt. Es werden nur die Vorwärtsstrangeinsätze gezeigt. Die Ausrichtung der angereicherten Peptide in NS6 (Protease) ist rechts dargestellt. Die Nummerierung oben im Alignment gibt die Positionen der Aminosäurereste in den Nichtstrukturproteinen an. Es wird das Jalview Zappo-Farbschema verwendet, bei dem aliphatische/hydrophobe Reste (I, L, V, A und M) Pfirsich sind, aromatische Reste (F, W und Y) Gold sind und positiv geladene Reste (K, R, und H) sind blau, negativ geladene Reste (D und E) sind rot, hydrophile Reste (S, T, N und Q) sind grün, konformativ spezielle Reste (G und P) sind magenta und Cystein ist gelb. Die ausgerichteten Peptidfamilien von links nach rechts in der Abdeckungskarte definieren die Anti-GI.1-Epitope in NS1/2 (p48), NS3 (NTPase), NS4 (p22), NS5 (VPg), NS6 (Protease) und NS7 (RdRp).

Als nächstes verglichen wir die Verteilung der Epitope für Antikörper, die durch eine HuNoV-Infektion hervorgerufen wurden, zwischen den verschiedenen Personen. Dies wurde durch den Vergleich der Coverage-Score-Karten erreicht, um die gemeinsamen und einzigartigen Epitope in der Kohorte von sechs Personen zu erkennen. Epitope wurden weiter verifiziert, indem der Anteil der In-Frame-Inserts in einem Fenster, das ein potenzielles Epitop enthält, mit dem Anteil der In-Frame-Inserts in der naiven Bibliothek verglichen wurde. Wenn die In-Frame-Insert-Häufigkeit der Bibliotheken nach der Affinitätsselektion höher ist als die der naiven Bibliothek in einem bestimmten Fenster, wird das Vorhandensein eines Epitops bestätigt (Abb. 4).

a Die Abdeckung der Inserts in der naiven Bibliothek (oben) sowie der Inserts nach zwei Runden der Affinitätsselektion mit Seren der Probanden 715, 720, 723, 731, 732 und 750 wurde durch DNA-Sequenzabgleich mit dem enthaltenden Plasmid bestimmt GI.1 ORFs. Der Pro-Nukleotid-Coverage-Score wird auf der y-Achse angezeigt, während die Position auf der Plasmidsequenz auf der x-Achse angezeigt wird. Als Referenz sind unterhalb der x-Achse die Positionen der HuNoV-ORFs 1 bis 3 dargestellt. Es werden nur die Vorwärtsstrangeinsätze gezeigt. b Der Anteil der In-Frame-Inserts in ORF2 in der naiven Bibliothek im Vergleich zu In-Frame-Inserts nach zwei Runden der Affinitätsselektion mit Seren der Probanden 715, 720, 723, 731, 732 und 750. Ein Schiebefenster aus acht Aminosäuren entlang des Gastrointestinaltrakts .1 ORF2 wird auf der x-Achse angezeigt, während der Anteil der In-Frame-Einfügungen der naiven Bibliothek (schwarze Balken) und der Bibliotheken nach zwei Runden der Affinitätsauswahl (rote Balken) auf der y-Achse angezeigt werden.

Wir identifizierten 13 Epitope in den Nichtstrukturproteinen. Es gibt drei prominente Epitope in NS1/2, die bei mehreren Individuen gefunden werden. Die Ausrichtungen zeigen, dass die Epitope den Aminosäurepositionen 131–190, 248–282 und 315–355 von ORF1 zugeordnet sind und bei einem, zwei bzw. einem Individuum gefunden wurden (Abb. 4a, 5, Tabelle S1). Weitere drei prominente Epitope befinden sich in NS3 und befinden sich an den Positionen 406–448, 498–554, jeweils bei einem Individuum, und 697–743, bei zwei Individuen. Das 7. Epitop ist 100 Aminosäuren lang und deckt die Positionen 759–858 von ORF1 in der N-terminalen Domäne (NTD) von NS4 ab. Wie bereits erwähnt, lässt die Länge dieser Sequenz darauf schließen, dass es sich um ein Konformationsepitop handelt. Dieses Epitop wurde bei fünf Personen gefunden. Das 8. Epitop befindet sich in NS5 an den Positionen 987–1037 und wurde bei allen sechs Individuen gefunden. Das 9. Epitop befindet sich in NS6. Dieses bei fünf Individuen gefundene Epitop umfasst 86 Reste von den Positionen 1095 bis 1180. Vier Epitope wurden in NS7 identifiziert und befinden sich an den Positionen 1311–1353, 1488–1539, 1577–1653 und 1709–1780 von ORF1 mit einer Länge von 43 , 52, 77 bzw. 72 Aminosäuren. Die ersten beiden NS7-Epitope wurden bei zwei Individuen gefunden, während das dritte Epitop bei einem Individuum und das letzte Epitop bei vier Individuen gefunden wurde (Abb. 4a, 5, Tabelle S1). Die Länge der Sequenzen legt nahe, dass es sich um Konformationsepitope handelt.

Das Dendrogramm vergleicht die gemeinsamen Epitopprofile der sechs Individuen. Rosa Blöcke zeigen Epitope für jedes Individuum in der angegebenen nichtstrukturellen oder strukturellen Proteindomäne an.

Um Epitope in VP1 zu identifizieren, haben wir ORF2 in 67 Fenster mit einer Länge von 24 Nukleotiden oder acht Aminosäureresten unterteilt. Ähnlich wie wir Epitope in ORF1 definiert haben, verglichen wir die Häufigkeiten der In-Frame-Inserts in den Bibliotheken nach der Auswahl und in der naiven Bibliothek. Wenn die Häufigkeit der In-Frame-Inserts der ausgewählten Bibliotheken höher ist als die in der naiven Bibliothek in einem bestimmten 8-mer-Fenster, haben wir die Inserts innerhalb des Fensters ausgerichtet, um ein Epitop zu identifizieren. Insgesamt identifizierten wir 35 Epitope in VP1, davon 19 in der S-Domäne, 12 in der P1-Subdomäne und vier in der P2-Subdomäne. Ähnlich wie die Epitope, die wir in den Nichtstrukturproteinen fanden, wurden die meisten VP1-Epitope von mehr als zwei Individuen geteilt, wobei fünf Epitope in allen sechs Individuen vorhanden waren, was darauf hindeutet, dass diese Epitope stark immunogen sind (Abb. 4b, 5, Tabelle S1).

In der S-Domäne gibt es 19 Epitope mit einer Länge von 12 bis 35 Resten. Wir haben auch drei Epitope kartiert, die vom scFv-Antikörper HJT-R3-A9 erkannt wurden. Basierend auf der Länge scheinen die meisten dieser Sequenzen lineare Epitope zu sein. Wir identifizierten 16 Epitope in der P-Domäne mit einer Länge von 8 bis 38 Resten. Die meisten dieser Sequenzen sind weniger als 20 Reste lang, was darauf hindeutet, dass es sich um lineare Epitope handelt (Abb. 4b, 5, Tabelle S1).

Obwohl die Mehrzahl der Epitope bei mindestens zwei Individuen gefunden wurde, ist die Konstellation der Epitope bei jedem Individuum einzigartig. Das heißt, keine zwei Individuen haben genau den gleichen Satz an Epitopen. Diese Ergebnisse lassen sich am besten in einem Dendrogramm visualisieren, das Ähnlichkeiten zwischen Individuen in den Sätzen erkannter Epitope zeigt (Abb. 5). Das Dendrogramm zeigt beispielsweise, dass die Individuen 731, 750 und 732 einen sehr ähnlichen Satz von Epitopen und damit eine ähnliche Antikörperreaktion haben, während die Individuen 720 und 750 eine unterschiedlichere Antikörperreaktion auf eine Infektion haben. Es ist auch interessant festzustellen, dass bei den Individuen 731 und 732, deren Seren 30 Tage nach der Infektion gesammelt wurden, mehr Epitope in VP1 beobachtet wurden als bei den anderen drei Individuen (715, 720 und 723), deren Seren 30 Tage nach der Infektion gesammelt wurden 14 Tage nach der Infektion (Abb. 4, 5).

Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse, dass die Antigenlandschaft alle nichtstrukturellen und strukturellen Proteine ​​umfasst, wobei jede Person in ihren polyklonalen Seren Antikörper gegen eine einzigartige Sammlung linearer und konformativer Epitope enthält, die dennoch in der Gruppe der Individuen weit verbreitet sind.

Frühere Studien haben geschätzt, dass die schützende Immunität gegen HuNoV-Infektionen zwischen 4,1 und 8,7 Jahren liegt32,33,34. Allerdings ist die mit der humoralen Immunität während einer Infektion verbundene Antigenlandschaft unklar. Daher führten wir eine Längsschnittstudie der Epitoplandschaft durch, die mit der Antikörperantwort im Verlauf von HuNoV-Infektionen bei mehreren Personen verbunden ist. Zu diesem Zweck untersuchten wir Seren, die über einen Zeitraum von 180 Tagen gesammelt wurden, einschließlich fünf verschiedener Zeitpunkte für die Studienteilnehmer 731, 732 und 750. Die fünf Zeitpunkte umfassten die Zeit vor der Infektion, 7, 14, 30 und 180 Tage nach der Infektion. Die nach zwei Runden der Affinitätsselektion für jeden Zeitpunkt erhaltenen Insert-Anzahlverteilungs- und Abdeckungswerte zeigten Epitope entlang der HuNoV-ORFs. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurden nur die Epitope in den Nichtstrukturproteinen markiert. Jeder der Studienteilnehmer hatte Antikörper, die definierte Epitope für HuNoV in den Seren vor der Infektion erkannten, was darauf hinweist, dass er zuvor mit HuNoV infiziert war (Abb. 6, S5). Diese bereits vorhandenen Epitope wurden verifiziert, indem bestätigt wurde, dass der Anteil der In-Frame-Inserts in den ausgewählten Bibliotheken größer war als in der naiven Bibliothek. Alle bei Individuum 731 identifizierten Epitope existierten bereits und die meisten von ihnen blieben während des gesamten Infektionsverlaufs bestehen. Es gab drei Epitope, die nach der Infektion bei Versuchsperson 732 auftraten, die ersten Epitope in NS1/2, NS5 und NS6, und ein Epitop, das nach der Infektion bei Versuchsperson 750 auftrat, das erste Epitop in NS7 (Abb. 6, S5). Der Rest der Epitope in den Probanden 732 und 750 existierte bereits.

Die Bedeckung der Inserts nach zwei Runden der Affinitätsselektion mit Seren, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten von den Probanden 731, 732 und 750 gesammelt wurden, wurde durch DNA-Sequenzabgleich mit dem Plasmid, das GI.1-ORFs enthält, bestimmt. Der Pro-Nukleotid-Coverage-Score wird auf der y-Achse angezeigt, während die Position auf der Plasmidsequenz auf der x-Achse angezeigt wird. Als Referenz sind unterhalb der x-Achse die Positionen der HuNoV-ORFs 1 bis 3 dargestellt. Es werden nur die Vorwärtsstrangeinsätze gezeigt. a Die Abdeckung der Inserts nach zwei Runden der Affinitätsselektion mit Seren der Versuchsperson 731 vor der Herausforderung und 7, 14, 30 und 180 Tage nach der Herausforderung. b Die Abdeckung der Inserts nach zwei Runden der Affinitätsauswahl mit Probanden-732-Seren vor der Herausforderung und 7, 14, 30 und 180 Tage nach der Herausforderung. c Die Abdeckung der Inserts nach zwei Runden der Affinitätsselektion mit 750 Probandenseren vor der Herausforderung und 7, 14, 30 und 180 Tage nach der Herausforderung. Gepunktete Linien stellen bereits vorhandene Epitope dar, die aus Seren vor der Infektion bis 180 Tage nach der Infektion bestehen bleiben, während durchgezogene Linien Epitope darstellen, die nach der Infektion auftreten.

Unter den Epitopen, die nach der Infektion auftraten, zeigte das Epitop in NS5 bei allen drei Personen eine erhöhte Anreicherung und erreichte die höchsten Abdeckungswerte nach 14 und 30 Tagen für die Probanden 731 und 750 und nach 14 Tagen für die Probanden 732. Die Epitope in NS4 und NS6 bei Proband 732 zeigte sich auch eine höhere Anreicherung 14 Tage bis 180 Tage nach der Infektion. Dies weist darauf hin, dass zu Beginn der Infektion bei verschiedenen Personen Immunantworten induziert wurden, die auf Kombinationen der Epitope in NS4, NS5 und NS6 abzielten. Schließlich sind 180 Tage nach der Infektion die Insertzahlen und Abdeckungswerte für die meisten Epitope wieder auf die vor der HuNoV-Herausforderung beobachtete Ausgangs-Epitoplandschaft zurückgekehrt. Insbesondere blieben Antikörper, die nach der Infektion als Teil der adaptiven Reaktion induziert wurden, auch am Tag 180 bestehen (dh NS4 und NS6 für Proband 732). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die Epitoplandschaft zwischen Individuen unterschiedlich ist und dass die während einer HuNoV-Infektion vorhandenen Antikörper eine Kombination aus bereits vorhandenen Antikörpern sind, die vermutlich aus einer früheren Infektion stammen, sowie neuen Antikörpern, die durch die HuNoV-Herausforderung induziert wurden. Bemerkenswert ist, dass diese bereits vorhandenen, persistenten Antikörper offenbar keinen Schutz vor einer Infektion boten, da alle diese Personen in Gegenwart der Antikörper infiziert wurden.

Noroviren sind genetisch vielfältig und werden grob auf der Grundlage der Sequenzidentität in 10 verschiedene Genogruppen eingeteilt und weiter in 49 Genotypen4 unterteilt. Im Idealfall würde ein Norovirus-Impfstoff auf Epitope abzielen, die über Genogruppen und Genotypen hinweg konserviert sind. GII.4 HuNoVs waren in den letzten 15 Jahren weltweit für die meisten Ausbrüche verantwortlich35,36,37. Sie lösen auch schwerwiegendere Symptome aus, die bei Kindern eine intensive medizinische Versorgung erfordern38. Um mehr über die Kreuzreaktivität der Immunantwort gegen HuNoVs sowie die Antigenlandschaft des GII.4-Norovirus zu verstehen, haben wir eine GII.4 HOV-gescherte genomische Phagen-Display-Bibliothek erstellt und dabei die gleichen Methoden verwendet, die für GI.1 beschrieben wurden Bibliothek. Eine Tiefensequenzierung der naiven GII.4-HOV-Bibliothek ergab eine dichte Verteilung sowohl der Vorwärts- als auch der Rückwärtsinserts entlang der Plasmidsequenz mit den GII.4-HOV-ORFs (Abb. 7a, b). Ungefähr acht Millionen Vorwärts-Inserts und fünf Millionen Reverse-Inserts wurden ausgerichtet, um einen Positionsabdeckungswert pro Nukleotid zu erhalten (Abb. 7c). Die Ergebnisse zeigten eine hervorragende Abdeckung an jeder Nukleotidposition des Plasmids, das das GII.4-HOV-Genom enthielt, das zum Aufbau der Bibliothek verwendet wurde. Die Verteilung der durch die Inserts kodierten Peptidgrößen reicht von etwa 10 bis 180 Aminosäuren mit einer durchschnittlichen Größe von 58 Aminosäuren (Abb. 7d). Ähnlich wie die GI.1-Bibliothek wies die GII.4-HOV-Bibliothek eine kontinuierliche Verteilung der Peptidgrößen auf, was darauf hinweist, dass die Insertgrößen sehr unterschiedlich sind.

a Verteilung der Vorwärtsstrang-Inserts (rot) in der naiven Bibliothek, kartiert auf ihre Positionen im Plasmid, das die GII.4 HOV-ORFs enthält. Die Position des 5'-Endes des Inserts im Plasmid ist auf der x-Achse dargestellt, während die Position des 3'-Endes des Inserts auf der y-Achse angegeben ist. Die Anzahl der Vorkommen der Einfügung wird als Anzahl auf der Z-Achse definiert. b Verteilung der Reverse-Strang-Inserts (schwarz) in der naiven Bibliothek. c Abdeckung der durch DNA-Sequenz-Alignments definierten naiven Bibliothek. Insgesamt wurden 8.364.766 Vorwärtsstrang-Inserts und 5.535.252 Rückwärtsstrang-Inserts ausgerichtet, um einen Coverage-Score pro Nukleotidposition zu generieren. Der Coverage-Score wurde als die Anzahl des Vorkommens jeder Nukleotidposition im Satz von DNA-Insert-Fragmenten definiert, die für die Vorwärtsstrang-Inserts bzw. Rückwärtsstrang-Inserts ausgerichtet waren. Die Abdeckungswerte für die Vorwärtsstrang-Inserts des Plasmids (rot) werden über der x-Achse angezeigt, während die Abdeckungswerte für die Rückstrang-Inserts (grau) unterhalb der x-Achse angezeigt werden. d Verteilung der Peptidgröße in der naiven Bibliothek. Die Häufigkeit jedes einzelnen Peptids wird auf der y-Achse angezeigt, während die Peptidgröße auf der x-Achse angezeigt wird.

Wir führten Affinitätsselektionen unter Verwendung der GII.4-HOV-Bibliothek gegen Seren von drei Personen mit hohen Anti-GII.4-Sydney-2012-Antikörperspiegeln im Serum durch, von denen einer (BCM16-1) kürzlich eine Infektion mit dem GII.4-Sydney-2012-Virus hatte. Wir führten zusätzlich eine Affinitätsselektion unter Verwendung der GII.4-HOV-Bibliothek gegen den scFv-HJT-R3-A9-Antikörper und Kaninchen-Anti-GI.1-VLP-Antiseren durch, die beide GI.1 VP1 binden. Die Häufigkeit von Inserts, die In-Frame-HuNoV-Peptide in der naiven GII.4-HOV-Bibliothek kodieren, und nach jeder Runde der Affinitätsselektion wurde bewertet. Abbildung S6a zeigt, dass die Affinitätsselektion ähnlich wie die Affinitätsselektionen von Runde eins bis zwei unter Verwendung der GI.1-Bibliothek an HuNoV-Sequenzen angereichert ist, die an Serumantikörper binden. Der Anteil der In-Frame-Einfügungen für jede Zählnummer begann, wie in Abbildung S6b dargestellt, auch bei Einfügungen mit einer Zählung von fünf zuzunehmen, wenn auch nicht so offensichtlich wie bei den Ergebnissen für GI.1. Die Inserts mit einer Anzahl von fünf oder mehr wurden zur Berechnung der Coverage-Scores pro Nukleotidposition verwendet.

Die nach der Tiefensequenzierung der GII.4-HOV-Bibliotheksselektionen erstellten Insert-Anzahl- und Abdeckungskarten zeigten Epitope, die sich in NS1/2 (p48), NS3 (NTPase), NS4 (p22), NS5 (VPg), NS6 (Protease) befinden. und NS7 (RdRp) (Abb. 8, S7, Tabelle S2). Epitope, die aus den Seren aller drei Individuen auf NS1/2 abgebildet werden, teilen sich ein Epitop von den Resten 68 bis 113 von ORF1. Das Epitop in NS3 wurde ebenfalls von allen drei Personen geteilt und ist 81 Reste lang (395–475), was darauf hindeutet, dass es sich um ein Konformationsepitop handelt. Das Epitop in NS4 erschien auch bei allen drei Individuen mit einer Sequenz von 78 Resten (702–779). Das Epitop in NS5 weist zwei Reste auf, die den C-Terminus von NS4 überlappen und bei allen drei Individuen auftraten. Dieses Epitop hat eine gemeinsame Sequenz von 69 Resten (872–942), was darauf hindeutet, dass es sich um ein Konformationsepitop handelt. Schließlich überlappt das Epitop in NS6 NS5 und NS6 wird auch von allen drei Individuen geteilt und befindet sich von Position 982 bis 1029 von ORF1. Das letzte Epitop war nur im Subjekt BCM16-1 vorhanden und befindet sich in NS7. Dieses Epitop ist 64 Reste lang (1220–1283), was wiederum auf ein Konformationsepitop hindeutet (Abb. 8, S7, Tabelle S2).

a Die Abdeckung der Inserts in der naiven Bibliothek (oben) sowie der Inserts nach zwei Runden der Affinitätsselektion mit Seren von Probanden, BCM16-1-Seren, BCM13-1-Seren, BCM16-2-Seren, polyklonalen Anti-NV-Kaninchen-Antikörpern, und HJT-R3-A9-scFv-Antikörper, bestimmt durch DNA-Sequenz-Alignment mit dem Plasmid, das die GII.4-HOV-ORFs enthält. Der Coverage-Score pro Nukleotid wird auf der y-Achse angezeigt, während die Position auf dem Plasmid auf der x-Achse angezeigt wird. Die Positionen der GII.4 HOV ORFs 1 bis 3 werden als Referenz unterhalb der x-Achse angezeigt. Es werden nur die Vorwärtsstrangeinsätze gezeigt. b Der Anteil der In-Frame-Inserts in ORF2 in der naiven Bibliothek im Vergleich zu In-Frame-Inserts nach zwei Runden der Affinitätsselektion mit Seren der Probanden BCM16-1, BCM13-1, BCM16-2, polyklonalen Anti-NV-Kaninchen-Antikörpern und HJT -R3-A9 scFv-Antikörper in GII.4 HOV ORF2. Auf der x-Achse ist ein Schiebefenster mit acht Aminosäuren entlang GI.1 ORF2 dargestellt, während auf der x-Achse der Anteil der In-Frame-Inserts der naiven Bibliothek (schwarze Balken) und der Bibliotheken nach zwei Runden der Affinitätsselektion (rote Balken) dargestellt ist die y-Achse.

Die Affinitätsselektion der GII.4-HOV-Bibliothek gegen diese Ziele zeigte auch eine Anreicherung von Sequenzen aus VP1. Wie beim GI.1-Experiment haben wir ORF2 in 68 Fenster mit einer Länge von 24 Nukleotiden oder acht Resten unterteilt und die Häufigkeit der In-Frame-Inserts der ausgewählten Bibliotheken und der naiven Bibliothek in jedem Fenster verglichen. Die In-Frame-Inserts mit einer höheren Häufigkeit nach der Selektion als in der naiven Bibliothek wurden zur Identifizierung von Epitopen ausgerichtet. Wir identifizierten insgesamt 18 Epitope in VP1, davon 10 in der S-Domäne, vier in der P1-Subdomäne und vier in der P2-Subdomäne. Sechs Personen hatten ein einzigartiges Epitop. Unter den 30 Individuen, die mehr als zwei Epitope aufwiesen, waren bei allen sechs Individuen fünf Epitope in der NTD der S-Domäne vorhanden, was darauf hindeutet, dass diese fünf Epitope stark immunogen sind. (Abb. 8, Tabelle S2). Die Epitopprofile der Seren der drei Personen sowie des A9-Antikörpers und der Anti-NV-Kaninchenseren sind im Dendrogramm dargestellt, was zeigt, dass die Immunprofile zwischen dem A9-Antikörper und den Anti-NV-Seren am ähnlichsten sind Die Profile zwischen den Seren sind enger miteinander verwandt, wobei BCM16-1 und BCM16-2 das ähnlichste Epitopprofil aufweisen (Abb. S8).

Insgesamt wurden mit der GII.4-HOV-Bibliothek weniger Epitope gegen die Seren von GII.4-Sydney-infizierten Personen identifiziert als bei der Selektion der GI.1-Bibliothek gegen die Seren von GI.1-infizierten Personen. Dies ist wahrscheinlich auf die Verwendung der GII.4-HOV-Bibliothek gegen Seren von Personen zurückzuführen, die mit einem anderen GII.4-Genotyp infiziert sind. Darüber hinaus stammten die GII.4-Seren von natürlichen Infektionen und der Zeitrahmen zwischen Infektion und Serumentnahme ist unklar. Es wird erwartet, dass der Zeitpunkt der Serumentnahme Auswirkungen auf die beobachteten Epitope hat.

Da die Individuen nicht mit GII.4 HOV 2002 infiziert waren und gezeigt wurde, dass der A9-Antikörper und die Anti-Kaninchen-VLP-Seren GI.1- und GII.4-Epitope identifizieren, wurden die Epitope durch Affinitätsselektion der GII.4 HOV-Bibliothek im Vergleich zu diesen identifiziert Ziele wären kreuzreaktive Antikörper, die sowohl GI.1 als auch GII.4 erkennen. Um kreuzreaktive Epitope zu identifizieren und den Grad der Sequenzkonservierung innerhalb der Epitope zu bestimmen, haben wir die Sequenzen der HOV-Epitope GI.1 und GII.4 abgeglichen (Abb. S9a) und die prozentuale Identität (PI) zwischen den GI.1 berechnet und GII.4 HOV-Epitopsequenzen. Die Ausrichtung ergab, dass das NS7-Epitop unter allen Epitopen den höchsten PI-Wert von 81,4 % aufweist (Abb. S9a), was darauf hinweist, dass dieses Epitop zwischen den Genogruppen am stärksten konserviert ist. Das Epitop mit dem niedrigsten PI-Wert (27,5 %) ist das in NS1/2. Innerhalb von VP1 befindet sich das Epitop mit dem höchsten PI-Wert (79,5 %) in der S-Domäne oder dem 11. Epitop in Abb. S9a. Das Epitop mit dem niedrigsten PI-Wert (31,6 %) liegt in der NTD der S-Domäne bzw. dem 7. Epitop in S9a. Die hohe Konservierung der meisten kreuzreaktiven Epitope in den nichtstrukturellen und strukturellen Proteinen lässt auf eine mögliche Integration in einen breit schützenden Impfstoff schließen, wenn sie HBGA-blockierende Eigenschaften aufweisen. Darüber hinaus könnten sie als breitreaktive Diagnosewerkzeuge zur Erkennung von Norovirus-Infektionen eingesetzt werden (Abb. S9). Schließlich haben wir die Sequenzen der hier identifizierten Norovirus-Epitope mithilfe von Protein BLAST durchsucht und keine Übereinstimmungen mit hoher Sequenzähnlichkeit mit anderen Viren als Noroviren identifiziert. Daher sind die Antikörper, die die von uns identifizierten Epitope binden, wahrscheinlich spezifisch für Noroviren.

Zusammengenommen zeigten die Ergebnisse für die HOV-Postinfektionsseren GI.1 und GII.4, die Anti-NV-Seren und den scFv-HJT-R3-A9-Antikörper, dass Phagen-Display-Affinitätsselektionen in Verbindung mit Tiefensequenzierung bei komplexen polyklonalen Menschen eingesetzt werden können Seren zur gleichzeitigen Identifizierung mehrerer Epitope. Unsere Daten identifizierten 48 GI.1- und 24 GII.4-HOV-Epitope in den nichtstrukturellen und strukturellen Proteinen. Ähnliche Epitopprofile wurden bei infizierten Personen identifiziert, obwohl auch einzigartige Epitope vorhanden waren. Wir beobachteten auch, dass sich Epitope im Verlauf von Infektionen verändern, was die dynamische Natur der adaptiven Immunantwort verdeutlicht. Schließlich haben wir Antikörper beobachtet, die zwischen GI.1 und GII.4 HOV kreuzreaktiv sind. Die 10 Epitope, die von den kreuzreaktiven Antikörpern erkannt werden, haben das Potenzial, in einen Impfstoff oder ein Diagnosetool zum Nachweis von Norovirus-Infektionen integriert zu werden.

Hier haben wir gezeigt, dass Jun-Fos-unterstütztes Phagendisplay in Verbindung mit Tiefensequenzierung gleichzeitig mehrere Epitope aus komplexen polyklonalen menschlichen Seren kartieren kann. Wir nutzten diesen Ansatz mit GI.1- und GII.4-HOV-Genombibliotheken, um die Epitoplandschaft für neun komplexe polyklonale menschliche Seren von HuNoV-infizierten Personen und eine Längsschnittsammlung von 15 Seren aus fünf Zeitpunkten von drei infizierten Personen zu bestimmen. Unsere Daten zeigten bei jedem Individuum mehrere GI.1-Epitope, darunter Epitope sowohl in nichtstrukturellen als auch in strukturellen Proteinen. Anhand der Längsschnittserumproben beobachteten wir, dass alle Personen aufgrund der adaptiven Immunantwort infolge der GI.1-Herausforderungsinfektion sowohl bereits bestehende als auch neue Epitope aufwiesen. Darüber hinaus ermöglichte die Kartierung von Epitopen sowohl aus GI.1- als auch aus GII.4-Seren die Identifizierung kreuzreaktiver Epitope. Insgesamt liefern die Ergebnisse Einblicke in die humoralen Immunantworten auf eine HuNoV-Infektion.

Virusähnliche Partikel (VLPs), die aus dem Hauptstrukturprotein VP1 bestehen, sind hoch immunogen und aufgrund ihrer gut untersuchten Immunogenität und Epitopprofile Kandidaten für Impfstoffe39. Im Gegensatz dazu wurden die Immunogenität und Epitoplandschaften von nichtstrukturellen HuNoV-Proteinen nicht so gut charakterisiert. Es wurde jedoch gezeigt, dass ein Expressionsklon, der sich im C-Terminus von NS3 (NTPase) und N-Terminus von NS4 (p22) befindet und aus dem immunologischen Screening isoliert wurde, mit GI.1-Norovirus-Postinfektionsseren reaktiv war40. Ein anderer Bericht zeigte, dass Personen, die mit einem GI.1-Norovirus infiziert waren, eine Seroreaktion auf das nichtstrukturelle Fusionsprotein VPR zeigten, das aus VPg, Protease und RdRp41 besteht. Darüber hinaus wurde in einer kürzlich durchgeführten Studie, in der humorale Immunantworten gegen HuNoV bei Kindern in ganz Europa untersucht wurden, Antigenität bei NS1/2 (p48) und NS4 (p22)42 festgestellt. Unsere Arbeit erweitert das Verständnis der Immunogenität nichtstruktureller Proteine ​​erheblich durch die Identifizierung von Epitopen in mehreren nichtstrukturellen Proteinen, einschließlich der oben aufgeführten. Konkret identifizierten wir 13 GI.1-Epitope und sechs GII.4-HOV-Epitope in nichtstrukturellen Proteinen.

Die Lage von Epitopen auf Proteinstrukturen gibt Hinweise darauf, ob Antikörper, die diese Epitope binden, neutralisierende Aktivitäten besitzen. Es stehen Röntgenstrukturen von NS6 (Protease) und NS7 (RdRp)7,43,44,45,46 sowie Kernspinresonanzanalysen (NMR) des murinen Norovirus VPg und ein Homologiemodell von HuNoV VPg47,48 zur Verfügung. HuNoV NS5 (VPg) bindet kovalent an das 5′-Ende des viralen RNA-Genoms und ist an der Initiierung der viralen RNA-Replikation beteiligt. Die kreuzreaktiven NS5-Epitope für GI.1 (984–1037) und GII.4 HOV (872–942) (Abb. S9) sind auf den strukturierten helikalen Kern von VPg abgebildet und umfassen einen kritischen Tyrosinrest (Y992 in GI.1). und Y902 in GII.4 HOV), was darauf hindeutet, dass Antikörper, die an diese Epitope binden, den viralen RNA-Replikationsschritt direkt hemmen können47.

Wir identifizierten auch Epitope in HuNoV NS6 (Protease) sowohl im GI.1- als auch im GII.4-HOV. Das aus GI.1-Seren (1095–1180) nachgewiesene NS6-Epitop ist der Spalte der Protease zugeordnet, die wichtige katalytische Reste im aktiven Zentrum (H1130 und E1154) enthält (Abb. 9a)43,49. Antikörper, die auf dieses Epitop abzielen, könnten daher die katalytische Aktivität von NS6 hemmen. Das GII.4 HOV NS6-Epitop (Abb. 9b) ist auf die ersten 21 Reste abgebildet und umfasst nicht das aktive Zentrum der Protease43.

Lage der Epitope auf den Strukturen GI.1 Norwalk und GII.4 HOV NS6 (Protease), GI.1 NS7 (RdRp), GI.1 VP1 und GII.4 HOV VP1. Von links nach rechts werden für die a GI.1 NS6-Struktur (PDB-ID: 2FYQ), b vier Oberflächendiagramme angezeigt, die um 90 ° gegen den Uhrzeigersinn auf der y-Achse gedreht sind, und zwei Oberflächendiagramme, die um 90 ° gegen den Uhrzeigersinn auf der x-Achse gedreht sind GII.4 HOV NS6-Struktur (PDB-ID: 6NIR), c GI.1 NS7-Struktur (PDB-ID: 4NRT) und d GI.1 VP1 (PDB-ID: 1IHM), e GII.4 VP1 (PDB-ID: 7MRY) mit der Lage der Epitope.

Wir identifizierten vier Epitope im GI.1 NS7-Protein (RdRp), das für die Replikation der viralen RNA verantwortlich ist. Zwei der vier GI.1-NS7-Epitope überlappen das aktive Zentrum von NS7 in der Handflächenregion (D1522, D1623, D1624)50,51 und ein weiteres Epitop umfasst Reste in der Daumenregion (I1721, S1722, E1726, W1764, M1765). interagieren mit dem C-terminalen Schwanz in der Spalte des aktiven Zentrums während der RNA-Replikation52 (Abb. 9c). Daher könnten Antikörper, die an dieses GI.1-Polymerase-Epitop binden, die RNA-Synthese hemmen.

Wir identifizierten 35 Epitope im GI.1-Hauptkapsidprotein VP1, davon 19 in der S-Domäne, 12 in der P1-Subdomäne und vier in der P2-Subdomäne (Abb. 9d). Viele Epitope stimmten mit den von van Loben Sels und Green9 festgestellten Epitopen überein. Die ersten fünf Epitope, die sich über die Reste 6 bis 56 erstrecken, befinden sich in der NTD der S-Domäne und sind hoch immunogen, da sie bei allen sechs Probanden auftraten. Es gab 15 zuvor identifizierte GI.1-mAbs, die auch Stellen in der 1–43-Region des NTD der S-Domäne erkennen53. Die 14 anderen Epitope in der S-Domäne decken die meisten der acht β-Stränge B bis I7 ab. Es wurde nicht berichtet, dass diese Epitope neutralisieren. Die P2-Subdomäne ist die antigenreichste Region und enthält die Bindungsstelle für menschliches HBGA bei Virusinfektionen54. Wir haben vier Epitope in P2 identifiziert. Es wurde gezeigt, dass diese Epitope alle von HBGA-blockierenden oder neutralisierenden Antikörpern erkannt werden (Abb. 9d)5,55. Ein Großteil der Konformationsepitope, die von neutralisierenden Antikörpern wie 5I2 und mehreren Nanokörpern (Nano-7, Nano-62 und Nano-94) gebunden werden, sind auch in den 22. bis 25. Epitopen von GI.1 enthalten (Abb. 9d)56,57, 58.

Unsere GII.4 HOV-Ergebnisse zeigten 18 Epitope in VP1, davon 10 in der S-Domäne, vier in der P1-Subdomäne und vier in der P2-Subdomäne, wobei die meisten der identifizierten Epitope auch von van Loben Sels und Green9 diskutiert wurden. Viele Reste in den in den P1- und P2-Subdomänen identifizierten Epitopen sind auch über die GII-Genotypen hinweg konserviert. Beispielsweise ist eine kontinuierliche Sequenz im 4. und 5. Epitop in der GII.4 S-Domäne, die in Abb. 9e gezeigt ist, über GII.4, GII.7 und GII.8 hinweg hoch konserviert und wird vom MAb N2C359 erkannt. Das 11. P2-Subdomänen-Epitop in Abb. S9e enthält auch mehrere Reste (A294, G295, S296, N298), die über viele GII.4-Genotypen hinweg hoch konserviert sind und Teil von Epitop A sind, das zuvor als immundominantes Blockadeepitop60 identifiziert wurde. 61,62,63,64,65,66,67,68,69,70. Das 12. Epitop, das sich ebenfalls in der P2-Subdomäne befindet, enthält V327, einen hochkonservierten Rest in einem anderen Blockadeepitop (Epitop F), das von GII.4F erkannt wird, einem menschlichen monoklonalen Antikörper, der nach einer akuten Infektion erzeugt wird63,65,71,72,73. Das 12. Epitop enthält auch einen Teil des Blockadeepitops, das von einem GII-spezifischen monoklonalen Antikörper NORO-32074,75 erkannt wird. Das 11. und 12. Epitop befinden sich oben in VP1 (Abb. 9e). Unsere 16. und 17. Epitope in der P1-Subdomäne enthalten Reste innerhalb eines HBGA-blockierenden Epitops, das vom monoklonalen Antikörper 3C3G3 sowie den kreuzreaktiven monoklonalen Antikörpern NV23, NS22 und F12076,77,78,79 erkannt wird. Das 16. und 17. Epitop befinden sich auf der Seite des VP1 (Abb. 9e). Schließlich enthalten unsere 13. und 18. Epitope Reste in zwei subdominanten Blockadeepitopen, C und I, die nachweislich mäßige Blockade- und Neutralisationstiter aufweisen70. Die Epitope in den P1- und P2-Subdomänen, die wir in GI.1 und GII.4 HOV VP1 identifiziert haben, umfassen viele hochkonservierte, kreuzreaktive und Schlüsselreste, auf die HBGA-blockierende Antikörper abzielen. Es wurde gezeigt, dass Antikörper, die die HBGA-Blockierung hemmen, mit der klinischen Neutralisierung von GI.1 und GII.4 und dem Schutz vor HuNoV-Infektionen korrelieren10,12,80. Es wurde auch bestätigt, dass einige antigene Epitope stark neutralisierend wirken (z. B. Epitop A)70. Die HOV-Epitope GI.1 und GII.4, die HBGA-blockierende Reste enthalten, wären daher Kandidaten für den Einbau in Schutzimpfstoffe.

Unsere Ergebnisse zeigen deutlich, dass eine HuNoV-Infektion Antikörper hervorruft, die an nichtstrukturelle Proteine ​​binden. Allerdings werden nichtstrukturelle Proteine ​​in virusinfizierten Zellen hergestellt, und es ist nicht klar, wie diese Proteine ​​für die Interaktion mit B-Zell-Rezeptoren (BCRs) zur Verfügung stehen, um eine adaptive Antikörperantwort zu erzeugen. Durch die Zelllyse nach einer Infektion könnten nichtstrukturelle Proteine ​​zur Bindung an Lymphozytenrezeptoren freigesetzt werden, was zur Produktion von Antikörpern führt. Apoptose der infizierten Zelle ist ein möglicher Mechanismus für die Zelllyse zur Freisetzung nichtstruktureller Proteine. Lee et al. zeigten, dass das murine Norovirus NS1 und eine Form von HuNoV NS1 sezerniert werden81. Sie spekulierten, dass die NS1-Sekretion mit Apoptose gekoppelt ist, da sie durch die Caspase-3-Spaltung erleichtert wird. Eine andere Studie ergab, dass Apoptose durch Caspase-9-Aktivierung induziert wird, wenn nur ORF1-Polyproteine ​​des murinen Norovirus in einem eukaryotischen Zellsystem exprimiert werden82.

Eine weitere Frage ist, ob Antikörper gegen Nichtstrukturproteine ​​einen Schutz vor einer Infektion vermitteln könnten. Wie oben erwähnt, sind mehrere der identifizierten Epitope auf das aktive Zentrum oder funktionelle Regionen von Nichtstrukturproteinen abgebildet und könnten die Aktivität blockieren. Es ist jedoch nicht klar, wie Antikörper Zugang zu den Nichtstrukturproteinen erhalten würden, da die Proteine ​​in infizierten Zellen funktionieren. Ein weiterer Weg, wie die Antikörper den Schutz verbessern könnten, ist ihre Fc-Effektorfunktion. Von Nichtstrukturproteinen hervorgerufene Antikörper können Fc-vermittelte Effektorfunktionen aktivieren, die zur Beseitigung virusinfizierter Zellen verwendet werden, einschließlich antikörperabhängiger zellulärer Zytotoxizität (ADCC) oder antikörperabhängiger zellulärer Phagozytose (ADCP)83.

Obwohl es nur begrenzte Berichte über Epitope in nichtstrukturellen Proteinen von HuNoV gibt, haben mehrere frühere Studien gezeigt, dass nichtstrukturelle Proteine ​​anderer Viren reich an Epitopen sind. Beispielsweise wurden in einer Studie an COVID-19-Patienten IgG-Epitope in allen nichtstrukturellen und akzessorischen Proteinen von SARS-CoV-2 identifiziert84. Interessanterweise konzentrierten sich Epitope, die mit einer erhöhten Patientenüberlebensrate korrelierten, auf die NSP3- und NSP5-Proteasen, wohingegen IgG-Epitope, die sich in den akzessorischen Proteinen Spike, Nucleocapsid und ORF3a befinden, mit einer erhöhten Mortalität assoziiert waren84. Darüber hinaus führte die Entdeckung kreuzreaktiver Anti-NS1-Epitope in Dengue- und Zika-Viren zu der Vermutung, dass NS1 ein brauchbarer Impfstoffkandidat ist, und führte zu passivem Schutz in Tiermodellen85,86,87,88. Ob Epitope von HuNoV-Nichtstrukturproteinen Schutz vor Infektionen bieten, ist unbekannt. Unsere Ergebnisse in Verbindung mit den Erkenntnissen zu anderen Viren legen jedoch nahe, dass nichtstrukturelle Proteine, die kreuzreaktive Antikörper induzieren, Kandidaten für weitere Untersuchungen und mögliche Verwendung als Screening-Instrument zur Erkennung viraler Infektionen sind.

Unsere Ergebnisse zeigten auch die dynamische Natur der longitudinalen Antikörperantwort im Verlauf einer HuNoV-Infektion. In den Seren vor der Infektion identifizierte Epitope waren vorhanden, als nach der Infektion bei allen Studienteilnehmern De-novo-Epitope induziert wurden. Eine Erklärung für diese Beobachtung ist, dass die durch die Belastung induzierten Antikörper sowohl gegen den GI.1-Norwalk-Stamm als auch gegen Stämme gerichtet waren, die die Personen zuvor infiziert hatten. Diese Muster ähneln dem in der Influenzavirus-Immunologie beobachteten „Back-Boosting“, bei dem Immunantworten gegen Epitope im aktuell infizierenden Stamm sowie gegen die vorherigen Stämme induziert werden, wenn die Epitope eine hohe Homologie aufweisen89. Diese heterogene Immunität, bei der erhöhte Antikörpertiter gegen konservierte Epitope erzeugt werden, die zwischen dem aktuellen und dem vorherigen Stamm vorhanden sind, wurde kürzlich auch bei SARS-CoV-2-Infektionen beobachtet90,91.

Wir verwendeten eine GI.1- und eine GII.4-HOV-Genom-Phagen-Display-Bibliothek und führten Affinitätsselektionen gegen neun einzigartige menschliche Seren, 12 Seren aus verschiedenen Zeitpunkten von drei HuNoV-Infektionen, ein Kaninchen-Antiserum und einen monoklonalen scFV-Antikörper durch. Die Tiefensequenzierung von Inserts aus der Affinitätsselektion identifizierte Epitope in vielen nichtstrukturellen Proteinen. Welche Rolle diese Antikörper, wenn überhaupt, diese Epitope binden, für die Immunität ist unklar und bedarf künftiger Untersuchungen. Darüber hinaus ergab unsere Arbeit umfangreiche longitudinale Veränderungen der Epitoppersistenz während HuNoV-Infektionen. Schließlich identifizierten wir kreuzreaktive Epitope in Seren sowohl von GI.1- als auch GII.4-infizierten Personen, was darauf hindeutet, dass genogruppenübergreifende Antikörper während der Infektion hervorgerufen werden. Zukünftige Arbeiten mit Seren aus einer größeren Kohorte werden zu einem besseren Verständnis der Epitope und damit der Antikörperdynamik im Hinblick auf die Immunität gegen HuNoV-Infektionen führen.

Insgesamt wurden 21 Serumproben in diese Studie einbezogen. Sechs Personen, die während einer experimentellen Infektionsstudie mit GI.1 beim Menschen infiziert wurden, stellten 18 Proben30 zur Verfügung, und drei Personen mit natürlich erworbenen Antikörpern gegen GII.4 NoV lieferten einzelne Proben. Proben der Probanden 715, 720 und 723 in der GI.1-Studie wurden zwei Wochen nach der Belastung entnommen; Proben von 731, 732 und 750 wurden vor der Belastung und 1, 2, 4 und ~26 Wochen nach der Belastung gesammelt. Bei den Probanden 720, 723, 731 und 732 wurde nach der Belastung eine Gastroenteritis diagnostiziert, bei den Probanden 715 und 750 hingegen nicht30. Serumproben von BCM13-1 wurden im Jahr 2013 entnommen, während BCM16-1 und BCM16-2 im September bzw. Mai 2016 entnommen wurden. Die Studie wurde vom Baylor College of Medicine Institutional Review Board genehmigt.

Die GI.1 pTP663 Jun-Fos Phagendisplay-Bibliothek, die Inserts aus dem gescherten pKS-NV68 KM-Plasmid enthält, das GI.1 ORF1 bis ORF3 kodiert, wurde zuvor konstruiert25. Insgesamt 12,8 μg pKS-NV68-Plasmid wurden mit einem fokussierten Ultraschallgerät Covaris S2 auf einen Größenbereich von 100 bis 500 bp geschert. Die gescherte DNA wurde mit einer Qiagen PCR-Reinigungssäule gereinigt und in 50 μg 10 mM Tris-Cl-Puffer (pH 8,5) eluiert, was 56 ng/μl bzw. 2,8 μg als Endkonzentration bzw. DNA-Menge ergab. Die Enden der resultierenden 2,8 μg DNA-Fragmente wurden geglättet und in Puffer bestehend aus 50 mM Tris-Cl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM Dithiothreitol (DTT), 0,4 mM Desoxynukleosidtriphosphaten (dNTPs) und 15 Einheiten T4 phosphoryliert DNA-Polymerase (New England Biolabs [NEB]) und 50 Einheiten T4-Polynukleotidkinase (NEB) und 5 Einheiten Klenow-Fragment-DNA-Polymerase in einem Gesamtvolumen von 100 μg. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang bei 20 °C inkubiert, mit einer Qiagen PCR-Reinigungssäule gereinigt und in 10 mM Tris-Cl-Puffer (pH 8,5) eluiert.

Um die DNA-Fragmente für die Ligation mit dem Phagen-Display-Plasmid pTP663 Jun-Fos mittels AT-Klonierung vorzubereiten, wurde Desoxyadenosin zu den oben erwähnten endreparierten DNA-Fragmenten in einem 50-μl-Reaktionsgemisch mit 50 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl, 10 hinzugefügt mM MgCl2, 1 mM DTT und 0,2 mM dATP mit 15 Einheiten Klenow-DNA-Polymerase-Exonuklease (NEB). Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, gereinigt und in 10 mM Tris-Cl-Puffer (pH 8,5) eluiert.

Nach dem Wachstum in einem dam-negativen E. coli-Stamm wurde das Phagen-Display-Plasmid pTP663 Jun-Fos durch Reinigung der Plasmid-DNA mit einem Qiagen-Miniprep-Kit für die Klonierung vorbereitet. Insgesamt 9 μg Plasmid-DNA wurden mit XbaI in 1X NEB CutSmart-Puffer bei 37 °C für 2 Stunden in einem Volumen von 200 μl verdaut, gefolgt von der Inaktivierung von XbaI bei 65 °C für 10 Minuten. Die DNA-Enden der pTP663 Jun-Fos Phagen-Display-Plasmide wurden durch Zugabe von 4 μl 10 mM dNTPs und 2 μl Klenow-DNA-Polymerase (NEB) und 30-minütiger Inkubation bei 25 °C und anschließender Inkubation bei 70 °C geglättet C für 10 Min. Das Reaktionsgemisch wurde gereinigt und in 10 mM Tris-Cl-Puffer (pH 8,5) eluiert. Didesoxythymidin wurde der gereinigten DNA in einem 100-μl-Reaktionsgemisch mit 1X terminalem Desoxynucleotidyltransferase (TdT)-Puffer (NEB) mit 0,25 mM CoCl2, 0,2 mM ddTTP und 40 Einheiten TdT (NEB) zugesetzt. Die Reaktionsmischung, die T-Schwanz-Plasmide enthielt, wurde 1 Stunde lang bei 37 °C, gefolgt von 10 Minuten bei 70 °C, inkubiert und durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Die 5300 bp große pTP663-Bande wurde mit einem Qiagen-Gelreinigungskit extrahiert und in 80 μl 10 mM Tris-Cl-Puffer (pH 8,5) eluiert, was zu einer Endkonzentration von 6,7 ng/μl pTP663-DNA führte.

Die gescherte und A-tailed DNA von 100 bis 500 bp (1,45 μg) wurde mit der T-tailed pTP663-Vektor-DNA (0,13 μg) in einem 250 μl Reaktionsvolumen von 50 mM Tris-Cl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP ligiert , 10 mM DTT-Puffer bei 16 °C für 12 Stunden. Die Reaktion wurde dann mit Phenol-Chloroform-Isoamylethanol extrahiert, 1 Stunde lang in 2 Volumina 100 %igem Ethanol bei –80 °C ausgefällt und 15 Minuten lang bei 13.000 U/min zentrifugiert. Das DNA-Pellet wurde getrocknet und in TE-Puffer (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA [pH 8,0]) resuspendiert, gefolgt von der Elektroporation von 3 μl DNA in 50 μl elektrokompetente E. coli XL1-Blue-Zellen. Transformierte Zellen wurden mit 100 μg/ml Ampicillin auf Agarplatten selektiert. Die Bibliotheksgröße wurde anhand der Koloniezahl geschätzt und der Prozentsatz der Klone mit Inserts wurde durch Tiefensequenzierung der einzelnen Klone bestimmt. Die verbleibenden 445.000 Kolonien wurden gepoolt, indem LB-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin mit den Kolonien auf den Agarplatten zu einer Aufschlämmung vermischt wurde.

Die Phagenproduktion aus den gepoolten Bibliothekszellen wurde durch Zugabe von 0,1 ml der gepoolten Bibliothekszellen zu 30 ml 2YT-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin durchgeführt. Die Kultur wurde bei 37 °C unter Schütteln etwa 3 Stunden lang inkubiert, bis die optische Dichte bei 600 nm (OD600) 0,6 erreichte. Der KM13-Helferphage92 wurde zu 1 × 1010 Phagen/ml hinzugefügt und die Kulturen wurden 30 Minuten lang bei 37 °C ohne Schütteln und anschließend 20 Stunden lang bei 30 °C unter Schütteln inkubiert. Die Entfernung der E. coli-Zellen erfolgte durch Zentrifugation und die Fällung der Phagen erfolgte durch Zugabe von 1/5 Volumen 20 % Polyethylenglykol 6000 (PEG 6000), 2,5 M NaCl. Die Lösung wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert, durch Zentrifugation gewonnen und in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert. Die GII.4 HOV pTP663 Jun-Fos-Phagendisplay-Bibliotheksinserts aus dem gescherten pKS-SagaFpA50-Plasmid, das GII.4 HOV ORF1 bis ORF3 kodiert, wurden für diese Studie unter Verwendung der gleichen Methoden wie für das GI.1 pTP663 Jun-Fos-Phagendisplay beschrieben hergestellt Bibliothek.

Die erste Runde der Affinitätsselektion wurde durchgeführt, indem 100 μl (1 mg) Pierce Protein A/G-Magnetkügelchen (Thermo Scientific, Nr. 88803) in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und mit 1X TBS-T mit 0,05 % Tween gewaschen wurden. 20. Anschließend wurden 500 μl menschliche Seren (1:50 verdünnt) 1 Stunde lang in 1X TBS bei Raumtemperatur auf den Perlen immobilisiert. Die Kaninchen-Anti-GI.1-VLP-Antikörperseren wurden nach dem gleichen Verfahren auf Perlen immobilisiert. Der HJT-R3-A9 scFv-Antikörper wurde zuvor nach der Proteinexpression in E. coli25,93 gereinigt. Der Antikörper wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 200 μg/ml in 1X TBS auf den Perlen immobilisiert. Bei allen Proben wurden die Röhrchen nach dem Waschen mit 1 ml 1X TBS-T mit 0,05 % Tween-20 auf einen Magnetständer gestellt, wo die Magnetkügelchen gesammelt und der Überstand verworfen wurden. Die Perlen mit immobilisierten menschlichen Seren, Kaninchenseren und dem HJT-R3-A9-Antikörper wurden dann dreimal mit 1 ml 1X TBS-T mit 0,05 % Tween-20 gewaschen und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 1 ml 1X blockiert TBS-T mit 0,05 % Tween-20 und 0,5 % BSA. Die Perlen wurden dreimal mit 1X TBS-T mit 0,05 % Tween-20 gewaschen und 5 × 1011 Bibliotheksphagen wurden pro Röhrchen in 1X TBS zugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Perlen wurden dann dreimal mit 1X TBS-T mit 0,05 % Tween-20 gewaschen und die Phagen wurden mit 500 μl pro Probe 0,2 M Glycin (pH 2,2), 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA)-Elutionspuffer und eluiert neutralisiert mit 100 μl 2 M Tris (pH 8,5) pro Röhrchen. Ein Aliquot der eluierten Phagen (250 μl) wurde verwendet, um 1 ml E. coli XL1-Blue-Zellen zu infizieren. Diese Mischung wurde in 50 ml 2YT-Medium mit 100 μg/ml Ampicillin und insgesamt 1010 Phagen/ml inokuliert. oder 100 μl M13KO7-Helferphage (New England BioLabs, Nr. N0315S) und die Kultur wurde über Nacht bei 37 °C inkubiert, um die Phagen zu amplifizieren. Amplifizierte Phagen wurden mit PEG8000/2,5 M NaCl präzipitiert und durch 30-minütige Zentrifugation bei 4 kg gesammelt. Anschließend wurden die Phagen in 1X PBS resuspendiert und ein kleiner Aliquot zur Bestimmung des Phagentiters verwendet. Dieses Phagenpräparat wurde dann für die nächste Runde der Affinitätsselektion verwendet.

Amplikon-basiertes NGS mit der Illumina-Plattform wurde durchgeführt, um die DNA-Sequenzen von Inserts in der naiven Bibliothek und nach jeder Runde der Affinitätsselektion zu bestimmen25. Die PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung des amplifizierten Phagen der naiven Bibliothek und der angereicherten Bibliotheken als Matrize durchgeführt. Die PCR-Primer enthielten am 5'-Ende eine 7-bp-Barcode-Sequenz. Die Barcode-Sequenz ist für jedes PCR-Gemisch einzigartig und dient dazu, jedem Experiment Sequenzen zuzuordnen. Nach Agarosegelelektrophorese und Gelextraktion wurde die DNA extrahiert, mit einem Qiagen-Gelreinigungskit gereinigt, gepoolt und für Illumina NGS verwendet.

Benutzerdefinierte Perl-Skripte wurden für die Deep-Sequencing-Fastq-Dateien verwendet, um die Lesevorgänge oder Einfügungen in ihre jeweiligen Experimente basierend auf den Barcodes zu sortieren, die den Amplifikaten zugeordnet sind. Anschließend wurde ein weiteres benutzerdefiniertes Perl-Skript verwendet, um die Insert-Sequenzen mit dem Referenzgenom abzugleichen, um die Identität und Anzahl des Vorkommens jedes Inserts in jeder angereicherten Bibliothek und der naiven Bibliothek zu bestimmen. Das Programm Gnuplot wurde verwendet, um die 5′-Endpositionen, die 3′-Endpositionen und die Anzahl des Vorkommens jeder Einfügung auf der x-, y- bzw. z-Achse darzustellen. Für die Bestimmung des Coverage-Scores wurden die Beilagen mit einer Anzahl von 5 oder mehr ausgewählt. Die Coverage-Scores wurden mithilfe des Bedtools-Genomecov-Programms ermittelt und als Anzahl der Vorkommen pro Nukleotid für jedes Insert nach Ausrichtung auf das Referenzgenom definiert: pKS-NV68-Plasmid für die GI.1-Experimente und pKS-SagaFpA50-Plasmid für GII.4 HOV-Experimente27,28,94. Die Inserts, die sich im Leseraster von GI.1 und GII.4 HOV ORF1 bis ORF3 in den Plasmiden pKS-NV68 und pKS-SagaFpA50 befinden, wurden bestimmt und gezählt. Die GI.1 und GII.4 HOV ORF2 wurden in aufeinanderfolgende 8-mer lange Fenster unterteilt. Das Verhältnis der In-Frame-Einfügungen in einem Fenster für die naive Bibliothek und die Bibliotheken nach der Affinitätsauswahl wurde als Anzahl der Vorkommen der In-Frame-Einfügungen dividiert durch die Gesamtzahl der Einfügungen in jedem Fenster definiert. Das Verhältnis aller In-Frame-Inserts in der naiven Bibliothek und nach jeder Runde der Affinitätsauswahl für jedes Individuum wurde berechnet, indem die Anzahl der In-Frame-Inserts durch die Gesamtzahl der Inserts im Experiment dividiert wurde.

Zum Erstellen der Blöcke im Dendrogramm wurde ein benutzerdefiniertes Python-Skript verwendet. Seaborn, eine auf matplotlib basierende statistische Datenvisualisierungsbibliothek, wurde verwendet, um die Blöcke mit der erforderlichen semantischen Zuordnung und statistischen Aggregation zu gruppieren95.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Zur Verarbeitung der Deep-Sequencing-Daten wurden benutzerdefinierte Perl-Skripte verwendet, die unter dem Github-Link verfügbar sind: https://github.com/Palzkill-Lab/Norovirus_epitopes.

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Diese Arbeit wurde durch das NIH-Stipendium P01 AI057788 und teilweise durch U19 AI 144297 finanziert. Wir danken Eunna Huh für die Erstellung von Abb. 5 und der ergänzenden Abb. 7. Wir danken auch Nathaniel Jansen für seine Durchsicht der rechnerischen Analyse.

Abteilung für Pharmakologie und chemische Biologie, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, USA

Lynn Su, Wanzhi Huang und Timothy Palzkill

Abteilung für Molekulare Virologie und Mikrobiologie, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, USA

Frederick H. Neill, Mary K. Estes und Robert L. Atmar

Medizinische Abteilung, Baylor College of Medicine, Houston, TX, 77030, USA

Mary K. Estes und Robert L. Atmar

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LS führte die Phagen-Display-Assays durch, analysierte die Deep-Sequencing-Datensätze und verfasste das Manuskript. WH konstruierte die Phagen-Display-Bibliotheken und reinigte den in dieser Studie verwendeten Antikörper. RLA und FHN leiteten die experimentelle Infektionsstudie am Menschen, in der sie die in dieser Studie verwendeten Serumproben sammelten und charakterisierten. TP, MKE und RLA entwickelten die konzeptionelle Idee des Projekts und waren für die Gesamtplanung und Leitung des Projekts verantwortlich. TP, MKE und RLA waren auch für die kritische Überarbeitung des Manuskripts verantwortlich.

Korrespondenz mit Timothy Palzkill.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Su, L., Huang, W., Neill, FH et al. Die Kartierung menschlicher Norovirus-Antigene während einer Infektion zeigt die Breite der humoralen Immunantwort. npj Vaccines 8, 87 (2023). https://doi.org/10.1038/s41541-023-00683-1

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Eingegangen: 12. Oktober 2022

Angenommen: 25. Mai 2023

Veröffentlicht: 06. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-023-00683-1

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